葉酸對妊娠期鄰苯二甲酸二酯暴露致孕鼠及其胚胎損傷的防治作用

(北京軍區總醫院，北京 100700)

鄰苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯(DEHP)是目前市場上用量最大、最廣泛的鄰苯二甲酸酯類增塑劑，用于各種塑料產品甚至是食品包裝材料、醫用設備、兒童玩具、建筑材料制作［1］，其對機體健康的危害涉及生殖內分泌毒性、胚胎發育毒性、遺傳免疫毒性、神經毒性、氧化損傷等方面，其中DEHP對生物雌性生殖系統的損害不容忽視。葉酸是機體一碳單位轉移的輔酶，參與體內一碳單位的轉移和代射，與嘌呤、嘧啶合成有關，其對DNA、RNA的合成、細胞增殖和組織分化有重要意義。2010年5～7月，本研究用DEHP灌喂大鼠，觀察其胚胎毒性，并探討葉酸對DEHP暴露致孕鼠及其胚胎損傷的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康未生育3月齡SD大鼠75只，雌鼠50只，雄鼠25只，體質量200～300 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。飼養條件:室溫(24±2)℃，通風，相對濕度60% ±10%，光照12 h/d，自由攝食飲水。

1.2 藥品及試劑 DEHP(美國Sigma公司)，葉酸(北京芳草醫藥公司)，玉米油(天津嘉里糧油有限公司)，0.9%NaCl溶液(浙江濟民制藥有限公司)。

1.3 動物分組及處理 50只雌鼠隨機分為5組，每組10只?？瞻捉M給予生理鹽水，玉米油組給予玉米油，葉酸組給予葉酸60 mg/(kg·d)，DEHP組給予玉米油，實驗組給予玉米油+葉酸。劑量均為0.5 mL/100 g，每日8:00～10:00灌胃。實驗開始7 d后制備孕鼠模型，按雌、雄2∶1合籠交配，次晨8時查見陰栓者確定為妊娠0天，以此推算孕齡。所有雌鼠3 d內妊娠率100%，妊娠后各組繼續妊娠前給藥，DEHP組及實驗組另添加 DEHP 50 mg/(kg·d)，各組均給藥至妊娠19 d。

1.4 觀察指標 觀察孕鼠一般狀態、毛發、活動及攝食情況，妊娠19 d處死孕鼠，剖腹取胎，統計活胎、死胎、吸收胎數及植入胚胎總數，觀察胚胎畸形情況，測量胎鼠體質量及胎盤質量。取出孕鼠子宮、卵巢、肝臟，分別稱取質量，計算臟器指數，臟器指數=臟器質量/體質量×100%。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。數據以±s表示，行t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組孕鼠情況 實驗期間各組大鼠一般情況良好，外觀均未見異常，被毛光澤，活動佳，攝食正常，未發現病理反應。各組均未發現死胎、吸收胎及畸形胎，未見有陰道出血、早期或晚期流產及死亡等毒性反應。各組孕鼠體質量無顯著性差異(P均＞0.05);DEHP組與其他組相比，肝臟指數增加，卵巢、子宮指數降低(P均＜0.05);實驗組孕鼠體質量、臟器指數與空白組、玉米油組、葉酸組相比，P均＞0.05，但與 DEHP 組相比，P＜0.05。詳見表1。

表1 各組孕鼠體質量及子宮、卵巢、肝臟指數比較(±s)

表1 各組孕鼠體質量及子宮、卵巢、肝臟指數比較(±s)

組別 妊娠前體質量(g) 妊娠末體質量(g) 子宮指數(%) 卵巢指數(%) 肝臟指數(%)空白組 229.79 ±12.87 296.86 ±15.51 1.24 ±0.14 0.087 ±0.010 4.37 ±1.07玉米油組 228.15 ±14.10 292.16 ±25.83 1.30 ±0.05 0.091 ±0.004 4.55 ±0.28葉酸組 228.00 ±16.80 296.64 ±19.59 1.28 ±0.09 0.083 ±0.005 3.98 ±0.36 DEHP 組 229.37 ±11.06 298.12 ±22.04 1.00 ±0.12 0.070 ±0.009 5.48 ±1.17實驗組 226.15 ±17.22 307.55 ±25.37 1.27 ±0.11 0.088 ±0.013 4.35 ±0.88

2.2 各組活胎數量、胎鼠體質量、胎盤質量比較DEHP組的活胎數量、胎鼠體質量及胎盤質量低于其他各組(P均＜0.05)，實驗組與余各組相比，P均＞0.05。詳見表2。

表2 各組活胎數量、胎鼠體質量、胎盤質量比較(±s)

表2 各組活胎數量、胎鼠體質量、胎盤質量比較(±s)

組別 活胎數量(個) 胎鼠體質量(g) 胎盤質量(g)空白組13.29 ±2.24 5.92 ±0.34 0.98 ±0.13玉米油組 12.60 ±1.86 5.88 ±0.33 1.03 ±0.10葉酸組 13.65 ±2.62 5.95 ±0.42 1.04 ±0.05 DEHP 組 8.68 ±2.69 4.33 ±0.43 0.92 ±0.08實驗組12.34 ±2.19 5.78 ±0.53 1.04 ±0.10

3 討論

DEHP具有良好的抗靜電和耐低溫性能，多年來廣泛用于各種塑料產品、食品包裝材料、玩具和醫用材料的生產加工，同時也是其他化學工業產品及美容化妝品的重要成分［2］。加工過程中，由于DEHP與其他成分之間以氫鍵和范德華力連接，未形成化學共價鍵，隨著使用時間的延長或接觸到乙醇、油脂及受熱后易于釋出，揮發至外環境，難以降解，造成污染，并可在生物體內富集［3］，現已成為全球最為嚴重的化學污染物之一［4］。近年來國內外關于DEHP對人體的毒性作用報道較多［5］，由于女性特殊的生理特點和生活習慣，DEHP暴露的機會明顯高于男性，因而引起了學者對DEHP與女性生殖健康關系的關注。Davis等［6］建立了DEHP雌性生殖毒性的動物模型和細胞模型，Lovekamp等［7］認為DEHP對雌性毒性作用的靶器官是卵巢，但對孕期補充葉酸與DEHP毒性作用關系的研究尚未見報道。

DEHP可經胃腸道、呼吸道和皮膚等多種途徑進入機體，其中胃腸道為主要吸收途徑，有研究報道，經口給予小鼠DEHP后，DEHP及其代謝產物可廣泛分布于肝臟、血液、腎臟、胃腸道、生殖器官及脂肪組織中［8］。已有研究證實，DEHP及其代謝產物MEHP(鄰苯二酸-單-2-乙基己酯)對子宮、卵巢具有毒性作用，其可促進子宮內膜增生，抑制排卵前顆粒細胞產生 E2，改變自然排卵周期［9，10］。DEHP 的作用具有劑量、時間、年齡依賴性，有學者發現胚胎期DEHP暴露可影響子代大鼠的發育［11］。還有研究表明，女性長期接觸DEHP可引起受孕率下降和流產率升高，但其具體機制還不清楚［12］。王心等［13］研究發現妊娠期DEHP暴露可對母體及胎鼠造成損傷。本研究首先通過經口灌胃的方式使大鼠染毒，觀察大鼠妊娠前后暴露DEHP對其妊娠結局的影響和胚胎毒性作用。結果顯示，各組大鼠體質量均呈增長趨勢，無顯著性差異，表明DEHP染毒未對雌性大鼠生長產生明顯的抑制作用，但DEHP可造成肝臟指數增加，卵巢、子宮指數降低，對雌性生殖器官造成損傷。本研究還發現DEHP組的活胎數量、胎鼠體質量及胎盤質量低于其他各組，表明DEHP具有胚胎毒性作用。有學者認為DEHP的雌性生殖內分泌毒性作用主要是通過其代謝產物MEHP作用于卵巢顆粒細胞，影響卵巢功能而實現的，提示妊娠前后應盡量避免接觸DEHP。

葉酸是胚胎發育過程中必不可少的營養素，其可參與體內一碳單位的轉移和代射，是合成核酸必需的元素，而核酸的合成又是細胞增殖、組織生長和機體發育的物質基礎，葉酸缺乏可影響細胞分化、增殖及其功能。已有研究證實葉酸不僅與胎兒神經管缺陷、先心病有關，還與孕婦妊娠期高血壓、流產、胎兒宮內發育受限、畸胎等有關［14］。本研究結果顯示，經葉酸干預后，實驗組孕鼠臟器指數、胎鼠數量、體質量及胎盤質量與DEHP組相比有顯著性差異，接近其他各組，考慮葉酸對DEHP所致胚胎毒性具有一定的拮抗作用，可能與上述葉酸的生物功能有關。表明孕齡婦女妊娠前后適當補充葉酸制劑，有助于減少妊娠過程中DEHP暴露帶來的不良影響，達到健康生殖的目的，至于葉酸拮抗DEHP胚胎毒性作用的機理，還有待進一步深入研究。

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