兩種關鍵信號轉導通路活性狀態與K562細胞對DNR、Ara-C敏感性的關系

(廣州醫學院第一附屬醫院，廣州 510120)

近年來研究發現，白血病存在Ras/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶人第10染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)/蛋白激酶(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)和(或)Ras/Raf/細胞外信號調節酶(MEK)/絲裂原活化蛋白激酶(ERK)等關鍵信號轉導通路的異常［1，2］。磷酸化蛋白如 p-Akt和 p-ERK1/2 的激活，會使腫瘤細胞增殖潛能、逃避凋亡和免疫殺傷的能力增強，腫瘤細胞增殖失控，對誘導凋亡的藥物敏感性下降并導致耐藥性產生［3，4］。這些信號轉導通路的磷酸化蛋白有望作為分子靶向治療的位點之一。2011年10～12月，本研究對粒細胞白血病細胞株K562采用通路靶點抑制劑U0126(MEK抑制劑)、LY294002(PI3K抑制劑)和雷帕霉素(mTOR抑制劑)以及激活劑佛波酯(PMA，ERK激活劑)進行處理，觀察兩種關鍵信號通路的活性狀態與K562細胞對柔紅霉素(DNR)和阿糖胞苷(Ara-C)敏感性的關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RPMI1640和胎牛血清購自美國Gibco公司;細胞固定液(含16%甲醛)、細胞破膜液Ⅲ(含90%甲醇)、Stain Buffer、Annexin Ⅴ/PI凋亡試劑盒購自美國Becton Dickinson公司;IGG1鼠抗人單克隆抗體、p-Akt T308-PE、p-Akt S473-Alexa 647、p-ERK1/2-Alexa 488購自美國Becton Dickinson公司;U0126、LY295002、雷帕霉素、佛波酯(PMA)購自美國Sigma公司;柔紅霉素購自深圳萬樂公司;阿糖胞苷購自哈爾濱萊博通公司;K562由廣州醫學院附屬腫瘤醫院生物工程室饋贈。

1.2 細胞培養及分組 將K562置于含有15%胎牛血清(FPS)的RPMI1640培養液中，在37℃、含5%CO2、飽和濕度的恒溫孵育箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。用含有10%FPS的RPMI1640重懸K562細胞，使細胞密度達到(1～5)×106/mL。將細胞分為5個組，經U0126、LY294002、雷帕霉素處理的細胞分別為抑制劑A、B、C組，經PMA刺激的細胞為激活劑組，未作處理者為對照組。

1.3 K562中磷酸化蛋白的檢測 細胞內磷酸化蛋白抗體標記:IGG1陰性對照管為IGG1-Alexa 488/IGG1-PE/IGG1-Alexa 647;磷酸化抗體標記管為p-ERK1/2-Alexa 488/p-Akt T308-PE/p-Akt S473-Alexa 647。根據所標記單抗使用要求，K562分別予固定、破膜處理后［1］，加入上述單抗進行胞內磷酸化信號蛋白的標記。采用磷酸化流式細胞術檢測K562中的 p-ERK1/2、p-Akt T308 和 p-Akt S473。

1.4 細胞凋亡檢測 將5組細胞分別加入DNR、Ara-C，對照組不加藥。細胞于37℃、5%CO2環境中孵育48 h。采用AnnexinⅤ/PI標記法檢測細胞凋亡率。取細胞密度為(1～5)×106/mL的細胞懸液1 mL，分別加入AnnexinⅤ和PI，混勻，室溫避光孵育15 min。加入Wash Buffer上流式細胞儀檢測。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組K562中磷酸化蛋白的表達變化 見表1。

表1 各組K562中磷酸化蛋白的表達變化(%，±s)

表1 各組K562中磷酸化蛋白的表達變化(%，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05

組別p-Akt T308 p-Akt S473 p-ERK1/2對照組83.24 ±14.29 51.82 ±1.32 54.55 ±30.56激活劑組 94.70 ± 3.53 72.55 ±5.44* 97.85 ± 3.07*抑制劑 A 組 87.35 ± 0.07 52.55 ±5.44 6.75 ± 0.50*抑制劑 B 組 57.60 ± 0.74* 17.00 ±0.29* 18.25 ± 1.48*抑制劑C組81.24 ±11.19 50.98 ±0.41 52.95 ±26.76

2.2 Ara-C和DNR作用后各組K562細胞凋亡率比較 見表2。

表2 Ara-C和DNR作用后各組K562細胞凋亡率比較(%，±s)

表2 Ara-C和DNR作用后各組K562細胞凋亡率比較(%，±s)

注:與對照組相比，*P ＜0.05

組別 K562細胞凋亡率Ara-C作用后 DNR 作用后對照組65.15 ±0.21 58.50 ±0.57激活劑組 48.10 ±2.83* 23.40 ±2.78*抑制劑 A 組 63.80 ±0.15 89.70 ±3.12*抑制劑 B 組 72.60 ±2.07* 79.70 ±1.26*抑制劑 C 組 82.50 ±0.33* 88.60 ±2.04*

3 討論

Ras/PI3K/Akt/mTOR是標準的生存通路，在白血病等多種惡性腫瘤中被激活。其初級效應分子Akt激活后轉入核內磷酸化一系列胞內底物，這些底物參與調控細胞凋亡、細胞周期進程、轉錄和轉化［5］。實驗證明，與沒有Akt激活的細胞相比，存在Akt活化的細胞株在化療藥物的作用下增殖力和集落生成能力增強［6］。研究表明，Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR通路活化與多種腫瘤發生耐藥有關，而阻斷Ras/PI3K/Akt/mTOR的磷酸化蛋白表達能快速誘導細胞凋亡，尤其適用于腫瘤的聯合治療［7］。ERKs位于一系列受體的下游，活化轉入核內磷酸化其他轉錄因子［8，9］，主要通過下調腫瘤細胞對藥物的敏感性從而產生耐藥。抑制Ras/Raf/MEK/ERK通路中的Raf和MEK能提高白血病的化療效果，糾正耐藥、改善患者生存質量［10］。

PMA是K562中 p-ERK1/2的強效激活劑［10］。在本研究中，K562經PMA刺激10 min后p-ERK1/2陽性表達明顯增強。由于Ras/Raf/MEK/ERK和Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR信號通路能通過通路間的共同位點(如FLT3-ITD、Ras、CREB等)發生相互作用［10］，所以 K562 中 p-Akt T308、p-Akt S473 的表達也有不同程度的升高。通路激活增強后，DNR、Ara-C所誘導的 K562凋亡減少，提示 Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路與腫瘤細胞抗凋亡、耐藥有關，與文獻［6］報道一致。

U0126是Ras/Raf/MEK/ERK通路中MEK的抑制劑，能阻止下游的ERKs將膜表面信號轉錄到胞內，從而阻斷通路活化［10］。本研究中，抑制劑A組中p-ERK1/2表達下降，DNR誘導的K562凋亡率與對照組相比明顯增加，但Ara-C誘導的K562細胞凋亡率與對照組相近。LY294002是PI3K的抑制劑，能通過級聯反應特異性抑制Akt的磷酸化［11］。我們采用LY294002作用K562后，細胞中p-Akt表達明顯降低，證明LY294002可以抑制p-Akt表達。DNR和Ara-C作用于抑制劑B組后，細胞凋亡率均較對照組明顯增加。雷帕霉素是mTOR抑制劑，它通過與FK506連接蛋白FKBP-12相結合，抑制下游轉錄因子作用的同時能反向抑制Akt，從而抑制因Ras/PI3K/PTEN/AKT/mTOR通路的異常激活［12，13］。但由于雷帕霉素是作用于 Akt下游的mTOR，所以本研究中我們未能檢測到p-Akt表達的下降。DNR和Ara-C分別作用后，抑制劑C組K562凋亡率較對照組均有所升高。上述結果說明，聯用Ras/PI3K/PTEN/AKT/mTOR通路抑制劑能增強白血病細胞對DNR和Ara-C的敏感性，抑制Ras/Raf/MEK/ERK通路能增強DNR的抗腫瘤效應，但對Ara-C誘導的細胞凋亡的作用不明顯。

有學者發現，抑制Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路能提高ADM和紫杉醇等藥物對伴有信號轉導通路異常激活的腫瘤的治療效果［6］。本研究中DNR作用后抑制劑A、B組的細胞凋亡率均較對照組增加，說明抑制 Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路能增強K562對DNR的敏感性。聯用Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR通路抑制劑也增強了Ara-C的抗腫瘤效應。提示Ras/PI3K/PTEN/AKT/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路激活與腫瘤對蒽環類藥物耐藥的產生有關，聯用通路抑制劑不僅能糾正耐藥，還可降低化療藥使用劑量，從而減少化療相關不良反應。但在本研究中，抑制K562Ras/Raf/MEK/ERK通路未能提高Ara-C的抗腫瘤效應。這可能與K562對信號轉導通路抑制劑的敏感性有差異有關。

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