心肌細胞裂解液對P19細胞向心肌細胞分化的誘導效果觀察

謝丹丹，張 雷，尹 青，馮 倩

(1河北醫科大學，石家莊 050017;2河北醫科大學第一附屬醫院)

P19細胞是一種小鼠的畸胎瘤細胞，通過條件培養可分化為包括心肌細胞在內的多種細胞。實驗證明P19細胞向心肌細胞分化的過程中，其細胞發育相關基因的表達及電生理學特征基本模擬了正常小鼠心肌發育過程［1］。近年來研究發現，在向心肌細胞誘導分化過程中，心肌微環境比單純化學誘導更為重要，提示心肌細胞裂解液有可能較好的誘導P19細胞向心肌細胞分化。2011年11月～2012年2月，我們觀察了心肌細胞裂解液誘導P19細胞向心肌細胞定向分化的效果。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 新生1～3 d SD大鼠，小鼠P19細胞系(本實驗室保存)，胎牛血清(Clark公司)，新生牛血清(PAA公司)，鼠抗人心肌肌鈣蛋白T單克隆抗體(cTnT，Abcam公司)，兔抗人連接蛋白43多克隆抗體(Cx43，中杉金橋)，β-actin(Stana Cruz公司)。

1.2 P19細胞分組及處理 將復蘇后傳代4代以上的P19細胞，以5×105/mL密度接種在鋪有低熔點瓊脂糖的6孔板中培養4 d，形成細胞聚集體。常規分離SD大鼠乳鼠心肌細胞，將生長較好的原代心肌細胞制成1×106/mL的細胞懸液，迅速置于－70℃冰箱內，4～5 h后取出融化，用吸管反復吹打細胞懸液，如此反復3次后，將細胞懸液離心，取上清液過濾即為心肌細胞裂解液。心肌細胞按4×105/mL接種于含10%FBS的完全培養基中，收集每日更換所得的培養基離心，DMEM高糖培養取上清液與培養基1∶1混合，即為心肌細胞條件培養液。將聚集4 d生長較好，形態規則、大小較一致的細胞聚集體吸出，以同等數量加入心肌細胞裂解液、心肌細胞條件培養液及完全培養基中，分別為A、B、C組。待細胞貼壁后，每天更換新鮮的誘導培養液。

1.3 定向誘導效果評價

1.3.1 細胞中cTnT的檢測 采用免疫組化SP法。分別取各組7、10 d的細胞爬片，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，按免疫組化SP法進行染色。一抗為cTnT抗體。以PBS代替一抗為陰性對照。細胞質內有棕黃色絲狀結構者為cTnT陽性細胞。

1.3.2 cTnT、Cx43的定量檢測 分別取各組7、10 d的細胞進行總蛋白提取后定量，制成凝膠上樣標本，經10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，PVDF膜轉移，cTnT(1∶1 000)和 Cx43(1∶400)進行免疫反應，電化學法顯色。底片經掃描儀透掃后，用Image J軟件對Western blot條帶進行定量分析，以β-actin作為內參，用目的蛋白的灰度值與β-actin灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。組間比較采用χ2檢驗和t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

P19細胞懸浮培養4 d形成球形聚集體后貼壁培養并誘導分化。A組4 d后邊緣有部分細胞爬出，7 d后邊緣爬出細胞體積變大，細胞核增大。10 d后體積變大的細胞增多，細胞伸展，突起長。B組有少量細胞發生變化，C組細胞無明顯改變。

A、B、C組 cTnT陽性細胞率分別為 5.0%、2.4%、0，A 組 ＞B 組＞C 組(P均 ＜0.05)。三組培養7、10 d細胞cTnT、Cx43相對表達量比較見表1。

表1 三組培養7、10 d細胞cTnT、Cx43相對表達量比較( ±s)

表1 三組培養7、10 d細胞cTnT、Cx43相對表達量比較( ±s)

注:與C組同一時間相比，*P＜0.05;與B組同一時間相比，△P ＜0.05

組別cTnT Cx43 A 組培養7 d 1.339 ±0.831＊△ 1.227 ±0.025＊△培養10 d 1.861 ±0.120＊△ 1.780 ±0.089＊△B組培養7 d 1.098 ±0.220* 1.029 ±0.040*培養10 d 1.690 ±0.626* 1.583 ±0.138*C組培養7 d 0.019 ±0.052 0.017 ±0.026培養10 d 0.170 ±0.035 0.097 ±0.023

3 討論

心肌環境對干細胞向心肌細胞的分化有重要作用。心肌環境包括體內心肌環境或體外“心肌樣”環境［2］。有學者用心肌細胞裂解液和心肌細胞條件培養液分別對胚胎干細胞(ESCs)進行誘導［3］，結果顯示，兩種方法均可在體外模擬心肌微環境［4，5］，誘導ESCs向心肌樣細胞分化。有學者使用催產素［6～9］聯合乳鼠心肌細胞條件培養液誘導ESCs分化，結果表明，ESCs分化的心肌細胞與正常心肌細胞一樣，在細胞膜上存在腎上腺素受體、膽堿能受體和Ca2+通道［10］，分化的早期對異丙腎上腺素、乙酰膽堿和維拉帕米的反應性均顯著高于其他實驗組，分化晚期隨著心肌細胞逐漸發育成熟，細胞對藥物作用的反應性增強，提示心肌細胞的條件培養液可能有促進心肌細胞分化的作用［11］。本實驗采用心肌細胞裂解液及心肌細胞條件培養液模擬體外心肌微環境，便于在體外對P19細胞向心肌細胞的分化進行直接而方便的實時、動態觀察。

cTnT是僅存在于心肌細胞中的特異性調節蛋白，主要存在于心肌收縮單位中肌原纖維的細肌絲上。Cx43是心肌縫隙連接中的主要蛋白，Cx43陽性說明心肌細胞間具有形成閏盤結構的形態學基礎［12～14］。

本實驗結果顯示，A組即心肌細胞裂解液組和B組即條件培養液組細胞中均有cTnT和Cx43的表達。同時，我們在實驗中發現心肌細胞裂解液中P19細胞的cTnT和Cx43表達強于心肌細胞條件培養液中的細胞，提示通過反復凍融裂解所得到的心肌細胞裂解液含有一些具有誘導P19細胞向心肌細胞分化功能的物質，而這些物質在心肌細胞裂解液中的濃度比條件液中高;或是具有誘導作用的物質在正常的心肌細胞內，但不能被分泌到細胞外間隙，只有心肌細胞裂解后才能被釋放［15］。實驗中我們發現心肌細胞裂解液對P19細胞向心肌細胞分化具有明顯的誘導作用，且實驗操作性強，其誘導機制有待于進一步研究。

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