宮頸癌組織中Sox-2的表達變化及意義

(北京軍區總醫院，北京 107000)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡率第2位。我國年均新發宮頸癌約13.15萬例，占全球總新發病例的28.8%，位居女性惡性腫瘤第1位［1］。近年來研究顯示腫瘤干細胞是腫瘤形成的重要原因［2］，其具有干細胞特性，在腫瘤細胞中所占數量少，但可以進行自我更新和多項分化，從而使腫瘤不斷生長［3］。研究發現在白血病、乳腺癌、腦膠質瘤、結腸癌、視網膜母細胞瘤、胰腺癌、肺癌等許多腫瘤中都存在有腫瘤干細胞［4～7］。近年研究表明，干細胞關鍵轉錄因子Sox-2基因是性別決定區因子，在胚胎干細胞維持自我更新及多向性發展過程中起著決定性的作用，是維持膠質瘤祖細胞增殖和遺傳特性的關鍵轉錄調節因子，其異常表達與肺癌、乳腺癌、口腔腫瘤、食管癌、睪丸干細胞腫瘤、腦膜瘤等許多腫瘤的發生、發展密切相關［8］。目前宮頸癌干細胞的研究尚處于初步階段，關于Sox-2基因在宮頸癌中表達的研究尚少見。2009年2月～2011年9月，本研究觀察了Sox-2蛋白及其mRNA在宮頸癌組織中的表達變化，為宮頸癌的診斷和治療從干細胞角度提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 宮頸癌組織標本84例，宮頸CIN組織標本66例，正常宮頸組織標本22例。宮頸癌及宮頸CIN組織分別來源于在北京軍區總醫院婦產科行手術切除治療、經病理證實的宮頸癌及宮頸CIN患者。其中宮頸癌患者年齡33～56歲，宮頸CIN患者年齡28～40歲。正常宮頸組織來源于行子宮肌瘤全切術的患者，患者年齡40～51歲。三組患者年齡相比，P均＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人Sox-2單克隆抗體購自美國Epitomics公司，鏈霉卵白素—生物素過氧化物酶(SP)標記的試劑盒及DAB均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Trizol Reagent試劑盒(美國Invitrogen公司)，2×Taq PCR Master Mix(北京天根生物技術有限公司)。

1.2.2 Sox-2蛋白的檢測 采用免疫組化SP法。標本行4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，用3%的H2O2抑制內源性過氧化酶活性，0.01 mol/L枸櫞酸鈉(pH 6.0)行抗原修復，在約100℃條件下加熱10 min，PBS洗片，10%BSA封閉非特異性位點10 min，一抗4℃孵育過夜，PBS代替一抗作陰性對照。PBS沖洗3遍，SP法染色，DAB顯色后行蘇木精復染，常規脫水、透明、干燥、封片。

1.2.3 Sox-2 mRNA的檢測 采用RT-PCR法。按照Trizol Reagent試劑盒說明書提取組織總RNA。按照2×Taq PCR Master Mix使用說明，在20 μL的反應體系中合成細胞總cDNA。PCR體系為50 μL，內含模板 2 μL，Taq 酶 12.5 μL，目的引物各 0.5 μL，補水至50 μL。反應條件除退火溫度外均為預變性94℃ 3 min，變性94℃ 30 s，退火58 s，延伸72℃ 30 s，共25個循環。Sox-2上游引物:5'-CCCTGTGGTTACCTCTTCC-3'， 下 游 引 物:5'-CTCCCATTTCCCTCGTTT-3'，退火溫度58℃，產物長度為295 bp;內參GAPDH上游引物:5'-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3'，下游引物:5'-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3'，退火溫度58℃，產物長度為616 bp。

1.2.4 結果判定 ①Sox-2蛋白:光鏡下 Sox-2蛋白主要定位于細胞核，部分胞質著色。免疫組化結果采用半定量計分法判定.按著色程度評分，不著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分;按陽性細胞百分比計分，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)，無陽性細胞記0分，陽性細胞百分比＜25%計1分，25% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計為4分。上述兩項評分乘積＜2分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(++)，＞6分為強陽性(+++)，+～+++判定為Sox-2蛋白表達陽性。②Sox-2 mRNA:用內參照GAPDH光密度值標化目的基因的光密度值進行半定量分析，得到Sox-2 mRNA的相對表達量:(Sox-2 mRNA光密度值/GAPDH光密度值)×100%。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2蛋白的表達比較 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2蛋白陽性表達率分別為85.71%(72/84)、36.36%(24/66)、0.18%(4/22)，三者相比，P均 ＜0.01。

2.2 Sox-2蛋白表達與宮頸癌臨床病理參數的關系

見表1。由表1可見，宮頸癌組織中Sox-2蛋白表達水平與患者年齡無關(P＞0.05);與宮頸癌淋巴結轉移、臨床分期、分化程度有關 (P均＜0.05)。

2.3 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2 mRNA的表達比較 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2 mRNA的相對表達量分別為0.877 ±0.208、0.463 ±0.093、0.243 ±0.023，Sox-2 mRNA在宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中的表達有顯著性差異(P均＜0.01)，Sox-2 mRNA的表達隨著宮頸癌病理學分級的上升而升高。詳見圖1。

3 討論

研究認為，宮頸癌中也存在腫瘤干細胞，對宮頸癌的發生發展有重要作用［9］。腫瘤干細胞來源于宮頸儲備細胞的一部分［10］，因此有關學者已將研究目標指向宮頸儲備細胞，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續感染是導致宮頸癌發病的重要因素，研究證實腫瘤細胞球來源于HPV感染的宮頸干細胞［11］，這類細胞可能具有自我更新和多項分化潛能，其常見標記物有 CK17、p63 和 p16［12］。馮定慶等［13］從19例子宮頸癌患者的腫瘤組織中分離獲得宮頸癌干細胞，并分離培養形成腫瘤細胞球，表達干細胞標志物Oct4和Piwil2蛋白，接種于裸鼠皮下12周后全部成瘤，其病理類型與來源標本一致。

表1 Sox-2蛋白表達與宮頸癌臨床病理參數的關系(例)

圖1 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2 mRNA的表達比較

Sox-2基因被認為在腫瘤干細胞的發生發育方面起重要作用。Sox是一類具HMGDNA結合區域特征性的轉錄因子家族［14］，在真核生物中高度保守的，其蛋白是重要的轉錄調控因子，在性別決定和分化、早期神經系統發育及多種組織器官的形成中具有重要作用。其中Sox-2亞型歸屬于該家族B群，參與誘導干細胞轉錄過程。研究發現，Sox-2是誘導干細胞的一個關鍵轉錄因子，其與KLF4、Oct4和c-Myc共同作用，可以誘導鼠和人成體細胞成多功能祖細胞(IPS)，表明其具有干細胞調控的特性。在Oct 4、Sox-2、NANOG和 LIN28聯合誘導時，也能使人成體細胞發生上述變化，誘導后的細胞還有胚胎干細胞特性。表明Sox-2具有干細胞多向分化調控的特性，提示Sox-2基因是維持干細胞特性的重要基因。有學者發現，Sox-2在肺癌［15］、食管癌和肛管鱗癌中的表達率分別為94%、96%和100%，在相應的腺癌中表達率21%、13%和17%，提出Sox-2有可能作為消化道腫瘤或其他腫瘤鱗癌和腺癌的分子區分標志性指標［13］。最新基因干涉研究表明，對Sox-2基因表達進行干涉可阻止乳腺癌細胞進入S期，使其細胞周期停留在G1期，并改變了細胞形態［16］。說明干預Sox-2基因表達能夠抑制腫瘤細胞增殖。

本研究在Ⅰ期及Ⅱa期宮頸癌患者中均檢測到Sox-2蛋白表達，說明宮頸癌組織中可能均存在數量不等、具有干細胞特征的多能性低分化或未分化的腫瘤細胞。這些表達Sox-2的具有干細胞特征的細胞可能就是宮頸癌干細胞，有希望在細胞分離純化和體內成瘤實驗中進行進一步分離和鑒定。本研究結果顯示，Sox-2蛋白陽性表達率及其mRNA相對表達量宮頸癌組織＞CIN組織＞正常宮頸組織，且Sox-2蛋白的表達隨宮頸癌分化程度的降低而增加。腫瘤細胞分化程度越低，其基因結構及表型越接近原始幼稚的干細胞，惡性程度相對較高的宮頸癌組織中存在具有干細胞特征的腫瘤細胞數量也較多。上述結果提示Sox-2可能參與了宮頸癌組織的癌變過程，并可能與宮頸癌的浸潤轉移關系密切，且其高表達的腫瘤其惡性程度高，這與國內外的研究結果一致［13～15］。

綜上所述，Sox-2與宮頸癌的發生發展有密切關系，研究Sox-2蛋白及基因在宮頸癌中的作用及其機制有助于進一步了解宮頸癌的生物學行為，有望為該病的早期診斷和治療提供新的分子靶點。

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