MTHFR基因多態性與法洛四聯癥的相關性研究

(河南省人口和計劃生育科學技術研究院，鄭州 450002)

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate，MTHFR)是人類同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)代謝途徑的關鍵酶，其能催化5，10-亞甲基四氫葉酸轉變為5-甲基四氫葉酸的還原反應。研究發現，MTHFR基因缺陷與心血管疾病發生有關［1］。MTHFR基因突變可導致酶活性降低，但除C677T位點外，人群中MTHFR基因突變發生頻率較低［2］。法洛四聯癥(TOF)是指肺動脈狹窄、室間隔缺損、主動脈騎跨及右室肥厚四種畸形并存的先天性心臟病(CHD)，約占全部CHD的10%，遺傳度為55%～65%，其中室間隔缺損和肺動脈狹窄是CHD中最常見的兩種畸形。2011年4月，我們對MTHFR基因多態性與TOF的相關性進行了分析，旨在進一步尋找TOF的致病易感基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 根據知情同意的原則，收集河南省胸科醫院和鄭州市兒童醫院經臨床表現、彩色多普勒超聲心動圖診斷的TOF患者136例為觀察組，男66例、女70例，年齡6個月～12歲;均排除心臟血管以外畸形，且染色體核型分析無異常。對照組為上述醫院同期經臨床表現和心臟彩色超聲檢查排除CHD及其他心臟結構畸形的住院患兒277例，男160例、女117例，年齡3個月～10歲。兩組一般資料具有可比性。

1.2 MTHFR基因多態性檢測 兩組均抽取外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)-Na2抗凝，置－70℃冰箱中備用;利用常規飽和酚—氯仿抽提法從全血中提取基因組DNA，測定DNA純度和濃度后－20℃保存備用。MTHFR基因多態性檢測步驟:①MTHFR-C677T引物:參照 Frosst等［3］的設計，上游引物5'-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3'，下游引物5'-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3'。②PCR 反應體系:總體積 25 μL，其中 ddH2O 18.5 μL，10 × 緩沖液 2.5 μL，10 mM 的 dNTPs 1 μL，12.5 pmol/μL 的引物各 1 μL，DNA 1 μL。③PCR 反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，58℃復性45 s，72℃延伸45 s，35個循環;72℃終末延伸10 min，最后置于4℃保存。④酶切與酶切產物電泳:10×限制性內切酶反應緩沖液1.0 μL，PCR擴增產物10 μL，限制性內切酶 Hinf I 1 μL，組成12 μL 的酶切反應體系，37℃消化酶切16 h，取出酶切產物。采用3%瓊脂糖凝膠電泳，85 V，45 min，最后在紫外凝膠成像系統檢測酶切產物及大小，分析基因型。⑤測序分析:擴增產物純化后送上海生工生物工程有限公司測序，結果采用ClustalX軟件與基因庫中野生型MTHFR基因序列進行序列對比分析(基因序列號:AY338232.1)。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件和Epi Info軟件對兩組MTHFR基因C677T位點基因型和等位基因頻率進行比較，P≤0.05為差異有統計學意義。采用Epi Infor2000軟件進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗分析。

2 結果

2.1 酶切及測序 PCR產物為198 bp，野生型677C/C不能被Hinf I酶切，純合突變型677T/T被Hinf I完全酶切為175 bp和23 bp兩個片段(其中23 bp片段由于太短而無法在凝膠上清楚顯示)，雜合型677C/T可部分被Hinf I酶切為198、175和23 bp三個片段(其中23 bp片段由于太短而無法在凝膠上清楚顯示)，見圖1。3種基因型通過DNA測序證實準確，見圖2。

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗情況 兩組MTHFR基因C677T位點基因分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明群體基因遺傳平衡，數據來自同一孟德爾群體。見表1、2。

圖1 MTHFR基因多態性酶切電泳圖

圖2 MTHFR基因C677T多態性位點3種不同基因型測序結果

表1 對照組MTHFR基因多態性位點遺傳平衡檢驗

表2 觀察組MTHFR基因多態性位點遺傳平衡檢驗

2.3 MTHFR基因型構成 觀察組共檢測出MTHFR基因純合突變53例(39%)，雜合突變60例(44%)，正常基因型23例(17%);觀察組純合型TT突變頻率高于對照組，P＜0.05(χ2=11.89);T等位基因攜帶者患TOF的風險高于C等位基因攜帶者(OR=0.553，95%CI為 0.412 3 ～0.741 4)，見表3。

表3 兩組MTHFR基因型構成比較［例(%)］

3 討論

TOF是最常見的紫紺型CHD，是胚胎期動脈干與心球分隔不均而導致的心臟流出道畸形。目前研究結果顯示，心臟神經嵴細胞在分化為心臟流出道細胞時若處于高濃度的Hcy環境中，就會改變凋亡相關基因表達，從而不能完成心臟流出道細胞心肌化過程，導致心臟畸形［4］。MTHFR是一種黃素蛋白，由MTHFR基因編碼。研究發現，人體MTHFR基因存在29種突變，其中最常見的為C677T突變，即677位核苷酸C→T(丙氨酸→纈氨酸)點突變。這種錯義突變使酶的耐熱性和活性均降低，可使血漿Hcy水平升高達3倍以上，導致中高度Hcy血癥。Hcy可選擇性作用于神經外胚層的特定部位，影響神經嵴細胞的分化、遷移、增殖。

本研究顯示，兩組413例樣本中檢測得到的MTHFR基因C677T位點多態性與SNP數據庫報道一致(http://www.ncbi.nln.nih.gov/SNP/)，其中觀察組純合型TT突變頻率和等位基因頻率顯著高于對照組。提示MTHFR基因C677T位點多態性與TOF存在相關性，即具有T等位基因的個體罹患TOF的風險增高。而Lee等［5］實驗結果表明，MTHFR基因多態性與CHD無相關性，特別是TOF。造成上述結果差異的可能原因如下:①MTHFR基因突變導致的Hcy水平變化與體內葉酸水平也存在相關性。雖然Hcy是一種損害心血管發育的危險因素，但是葉酸能有效拮抗Hcy的發育毒性［6］。有充足葉酸攝入且無其他半胱氨酸代謝酶缺陷時，即使存在MTHFR基因突變，Hcy水平也可無變化;葉酸供應缺乏時，MTHFR基因突變則可引起Hcy水平升高［7］。因此，不同地區、種族、人群及葉酸攝入量的差異將影響到相關疾病的發生，在下一步研究中應對這些與MTHFR基因突變相關的因素應進行重點分析。②上述實驗的設計不同。本實驗采用傳統的PCR酶切電泳和直接測序兩種方法相對比的實驗設計，減少了MTHFR基因C677T位點基因型分析的誤差。另外，筆者認為還應在TOF患者中進行MTHFR基因突變篩查和表達分析，以期更深入了解其在TOF發生中的作用。

總之，MTHFR基因 C677T位點基因突變與TOF存在相關性，其可能是TOF的易感基因，但仍需進一步擴大樣本進行深入研究。

［1］Wintner S，Hafner E，Stonek F，et al.Association of congenital cardiac defects and the C677T methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism［J］.Prenat Diagn，2007，27(8):704-708.

［2］Obermann-Borst SA，van Driel LM，Helbing WA.Congenital heart defects and biomarkers of methylation in children:a case-control study［J］.Eur J Clin Invest，2011，41(2):143-150.

［3］Frosst P，Blom HJ，Milos R.A candidiate genetic risk factor for vascular disease:a common mutation methylenetetra-hydrofolate reductase［J］.Nat Genet，1995，10(1):111-113.

［4］Boot MJ，Steegers-Theunissen RP，Poelmann RE，et al.Cardiac outflow tract malformations in chick embryos exposed to homocysteine［J］.Cardiovasc Res，2004，64(2):365-373.

［5］Lee CN，Su YN，Cheng WF，et al.Association of the C677T methylenetetrahydrofolate reductase mutation with congenital heart diseases［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2005，84(12):1134-1140.

［6］韓樹萍，彭宇竹，李靜，等.葉酸缺乏對孕鼠子代心臟超微結構及心臟發育相關基因表達的影響［J］.實用兒科臨床雜志，2007，22(10):774.

［7］van Beynum IM，Kapusta L，den Heijer M，et al.Maternal MTHFR 677C＞T is a risk factor for congenital heart defects:effect modification by periconceptional folate supplementation［J］.Eur Heart J，2006，27(8):981-987.