1株鴿新城疫病毒的分離、鑒定及生物學特性研究

仇微紅 葉賀佳李 敏 孫招金 王鑫 梁昭平,2 羅開健

（1 廣州市華南農大生物藥品有限公司 廣州 511300 2 華南農業大學獸醫學院 廣州 510642）

鴿Ⅰ型副黏病毒（Pigeon Paramyxovirus 1，PPMV-Ⅰ）病又稱鴿瘟或鴿新城疫，是一種由禽Ⅰ型副黏病毒引起的、流行于鴿群的高度接觸性急性傳染病，它以腸炎、嚴重腹瀉和神經癥狀為特征，是危害養鴿業的主要疫病之一[1]。筆者從廣東某鴿場發病鴿中分離到了1株新城疫病毒，通過血清學試驗進行了鑒定，并對該毒株進行了毒力指標測定 (ICPI、IVPI和MDT)、動物回歸試驗以及組織病理學觀察。現將試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗雞胚

10日齡SPF胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.1.2 試驗動物

30日齡雛鴿，購自江門市翔勝鴿場。

1.1.3 標準陽性血清

新城疫病毒、禽流感病毒（H5、H7、H9亞型）、EDSV76標準陽性血清，購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離

1.2.1.1 病料采集

在廣東省某大型鴿場某鴿群發生了臨床癥狀以神經癥狀、腹瀉為主的傳染病，病死率很高，尤其以1月齡以內的雛鴿發病嚴重，死亡率達83%。病鴿排綠色或黃綠色的水樣糞便，呈現頭頸后仰（觀星狀）、歪頭、扭頸、翅膀麻痹等神經癥狀。剖檢病死鴿發現腺胃、肌胃出血，胰臟有白色壞死點，肝臟出血，腦充血出血，采集了病死鴿的腦、胰臟、肝臟和肺臟做病原分離與鑒定。

1.2.1.2 病料處理

取死亡鴿子的腦、胰臟、肝臟和肺臟剪碎，研磨，加入適量PBS液，反復凍融3次，離心，取上清，按終濃度分別為1000IU/mL的青霉素和鏈霉素，置4℃過夜，0.22μm濾器過濾，濾液用于接種雞胚。

1.2.1.3 雞胚接種及血凝性

病料濾過液接種10個10日齡SPF雞胚，每胚接種0.2mL；去除24h內非特異死亡雞胚，收集24～72h內死亡胚的尿囊液。測定尿囊液是否有血凝性，并盲傳6代，每代測HA效價。

1.2.2 血凝抑制（HI）試驗

以常規方法測定F2、F6代尿囊液的HA效價，并以抗ND、禽流感 (H5、H7、H9亞型)、EDSV76標準陽性血清進行血凝抑制（HI）試驗。首先將收獲的尿囊液配成4HAU抗原，取96孔V型微量反應板，每孔加入25μL生理鹽水，第1排加25 μL標準陽性血清，每種血清做2個重復，然后將血清進行2倍系列稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μL棄去。稀釋后每排第1～11孔再加入25μL4HAU抗原，反應5～10min，最后加入1%紅細胞懸液25μL，用微量振蕩器混勻，室溫下靜置30～40min。

1.2.3 病毒ELD50的測定

將分離的病毒尿囊液F6代用無菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-6～10-105個稀釋度分別經尿囊腔途徑接種5枚10日齡的SPF雞胚，0.1mL/胚，置37℃孵育96h，24h前死胚為非特異性死亡，廢棄不計，記錄24～96h內死亡雞胚，按Reed-Muench法計算其ELD50。

1.2.4 毒力的測定

1.2.4.1 腦內接種致病指數（ICPI）測定

將分離的病毒尿囊液F6代以滅菌生理鹽水稀釋10倍，腦內注射出殼后24～36h的SPF雛雞10只，每只0.05mL，同時設5只對照（腦內注射滅菌生理鹽水0.05mL），隔離飼養，觀察8d[2]。記錄正常、發病與死亡雞的每日累計數，正常雞積分為0、發病為1、死亡為2，最后計算ICPI，ICPI=（8d累計發病數×1+8d累計死亡數×2）/8d累計雞只總數。

1.2.4.2 靜脈接種致病指數（IVPI）測定

將分離毒種F6代以滅菌生理鹽水稀釋10倍，翅靜脈接種42d SPF雞10只，每只0.1mL，同時設5只對照（靜脈注射滅菌生理鹽水0.1mL），隔離飼養，觀察10d。記錄正常、發病、麻痹與死亡雞的每日累計數，正常雞積分為0、發病為1、麻痹為2、死亡為3，最后計算 IVPI[2]，IVPI=（10d累計發病數×1+10d累計麻痹數×2+10d累計死亡數×3）/10d累計雞只總數。

1.2.4.3 MDT測定

將分離的病毒尿囊液F6代以滅菌生理鹽水分別稀釋成10-5～10-9，每個稀釋度分別接種9日齡SPF雞胚10枚，每胚0.1mL，37℃繼續孵化，棄去24h內的死胚，以后每天照蛋3次，記錄胚胎殘廢時間，取尿囊液測定HA效價，持續7d，取全部致死雞胚的最大稀釋度死胚的記錄，計算MDT[2]，MDT=（Xh×Xh死亡胚數+Yh×Yh死亡胚數）/死亡胚總數。

1.2.5 動物回歸試驗及病理切片觀察

F6代病毒尿囊液經10-2稀釋，通過滴鼻和肌肉注射的方式對30日齡左右的10只雛鴿進行攻毒，肌肉注射0.5mL/只。另設5只健康鴿作為空白對照。攻毒后觀察每組鴿的發病和死亡情況，觀察2周，并對發病及死亡鴿做組織病理學觀察。

2 結果

2.1 病毒分離、鑒定結果

2.1.1 各代次雞胚尿囊液HA效價

病料濾過液接種的10枚SPF胚中，有6枚于24～72h內死亡，胚體充血、出血，逐胚測定各代次雞胚尿囊液HA效價，F1～F6各代尿囊液平均HA效價分別為 23.6、25.3、26.5、27.2、28.3、210.0。

2.1.2 血凝抑制（HI）試驗結果

雞胚尿囊液血凝性僅被NDV的標準陽性血清所抑制，而不被禽流感（H5、H7、H9亞型）及EDS76標準陽性血清所抑制。

2.2 F6代病毒尿囊液病毒含量的測定結果

經測定，該分離株的ELD50為10-8.60/0.1mL。

2.3 毒力的測定結果

經測定，該分離株的ICPI為1.64，IVPI為2.2，MDT為 44.1h。

2.4 動物回歸實驗結果

攻毒后4d，所有試驗鴿精神沉郁，出現神經癥狀，表現頭頸后仰（觀星狀）、歪頭、扭頸及翅膀麻痹等，肛門周圍粘滿綠色糞便。剖檢可見肌胃、腺胃出血，腸黏膜出血，里面充滿黃色黏液，腦部也見輕微出血。組織病理學觀察腦部腦膜充血瘀血，血管周圍間隙增寬，淋巴細胞浸潤；脾臟瘀血，大量漿細胞聚焦；肝臟瘀血；腸道固有層大量漿細胞浸潤；氣管分泌旺盛，固有層瘀血，炎癥細胞浸潤（圖1～5）。

3 小結與討論

3.1 根據從發病鴿中分離到病毒具有血凝性，且能被抗NDV血清所抑制，而不被禽流感（H5、H7、H9亞型）及EDSV76標準陽性血清所抑制，以及動物回歸試驗結果及組織病理學檢查結果可以判定鴿群感染了新城疫病毒，病毒和以往報道[3-5]的關于鴿新城疫病毒的特性相一致。

圖1 腦部病理組織變化

圖3 肝臟病理組織變化

圖4 腸道病理組織變化

圖5 氣管病理組織變化

3.2 目前用于評價新城疫病毒毒力強弱的指標主要有 MDT、ICPI、IVPI，強毒的 MDT小于 60h，ICPI在1.5～2.0之間，IVPI在2.0～3.0之間。本研究中分離株的 ICPI為 1.64、IVPI為 2.2、MDT為 44.1h，符合強毒的標準。

3.3 鴿新城疫病毒感染為危害養鴿業的最主要的疾病之一，但對本病迄今尚無特異性的有效治療藥物，關鍵在于預防。盡管鴿新城疫病毒與雞的新城疫病毒為同一屬，但許多報道表明用現有的雞新城疫疫苗免疫鴿群后保護效果并不理想[6]。因此，分離、培育出免疫原性良好的毒株，研制出具有良好免疫效力的鴿用新城疫疫苗對預防本病至關重要。本研究中分離株的基因分型以及其免疫原性等有待進一步的研究。

[1]Kaleta E F，Alexander D J，Russell P H.The first isolation of the PPMV-I virus responsible for the current panzootic in pigeons [J].Avian poulty，1985，14：553-557.

[2]國際獸醫局(OIE)推薦的《動物疫病診斷方法和生物制品要求手冊》[M].1992,31-37.

[3]何葉峰，秦卓明，賈強.鴿I型副黏病毒的分離和鑒定[J].中國獸醫雜志，2002，38（11）.

[4]鄒永新，劉思伽.鴿I型副黏病毒病的病原特性[J].Poultry Science，2005，10：47-49.

[5]賀東生，姜崢嶸，陳學杰，等.鴿I型副黏病毒的分離和鑒定[J].中國動物防疫，2001，18（9）：26-28.

[6]張淑霞，楊增歧，趙余放，等.鴿新城疫油乳佐劑滅活苗對鴿免疫效果觀察 [J]. 中國預防獸醫學報，1999，21(3)：163-165.