低硒大鼠心肌線粒體硫氧還蛋白2的動態表達和心肌的損傷情況*

潘曉青，魏 瑾，張 明，林 琳，單 虎，閆 蕊，賀 樂

(西安交通大學醫學院第二附屬醫院心內科，陜西 西安 710004)

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)系統由 Trx、Trx還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)和還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)組成。Trx主要分為Trx1和Trx2。目前對該系統中TrxR和Trx1的研究已經相當廣泛，對Trx2功能的研究相對較少。已有研究顯示，它除了具有Trx家族基本的抗氧化應激作用外，還有保護內皮細胞、調節基因表達及促進細胞增殖等作用[1－3]。Trx2是存在于線粒體中的分子量12 kD的小分子蛋白，2000年Powis等[4]通過 Western blotting證實了 Trx2的線粒體定位。因其特異存在于線粒體又被稱為線粒體型硫氧還蛋白。Trx2是線粒體內膜蛋白中清除活性氧簇的主要蛋白，在維持細胞存活、降低氧化應激以及調節線粒體細胞凋亡信號轉導過程中起重要作用[5]。有研究顯示低硒及冰泳刺激等因素可影響Trx系統的表達[6]。但是低硒對特異存在于線粒體的Trx2蛋白表達的影響及Trx2對心肌細胞損傷的影響尚不清楚。本實驗擬對該問題作進一步研究。

材料和方法

1 主要試劑

心肌線粒體提取試劑盒購自北京寶賽;Trx2兔抗鼠多克隆抗體購自Proteintech;Fas相關死亡結構域蛋白(Fas－associated death domain protein，FADD)兔抗鼠多克隆抗體購自Bioss;辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)和超敏發光液購自Pierce Biotechnology，SP染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

2 動物

將36只2周齡SD大鼠隨機分成低硒(low selenium，LS)組及對照(normal control，NC)組，每組18只(雌雄比例相同)，低硒組以人工合成低硒酵母飼料喂養(硒含量0.01 mg/kg)，對照組以本校實驗動物中心提供的常規飼料喂養(硒含量0.1～0.3 mg/kg)。

3 主要方法

3.1 在體心功能檢測 分別于第20周、30周及40周時進行，每個時點各選6只大鼠(雌雄比例相同，實驗前禁食12 h)，20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔麻醉后，把大鼠仰臥固定于動物臺上，連接導管與壓力傳感器，計算機上校準基線。分離一側頸動脈，在頸動脈上剪一斜口，將動脈插管經該斜口送達左心室。固定動脈導管，穩定10 min，記錄的主要指標有:左心室峰值收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左心室內壓最大上升和下降速率(maximum rate of left ventricular pressure rise/decay，±dp/dtmax)。取10組連續穩定的數據，以Chart 5 for Windows軟件進行分析。

心功能測量完畢后，麻醉狀態下快速取心臟。用刀片切取1塊大小約(3～5)mm×(3～5)mm×(10～15)mm的心肌組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h后包埋成石蠟標本，用于免疫組化染色。另取約200 mg心肌組織，按線粒體提取試劑盒的說明提取心肌線粒體。

3.2 蛋白質免疫印跡(Western blotting) 用RIPA裂解液提取線粒體蛋白，超微量紫外分光光度儀對提取的蛋白進行定量后行Western blotting檢測，每梳孔上樣量30 μg，凝膠電泳分離后半干轉移法轉到PVDF膜上。Trx2的轉膜條件為恒流1 mA/cm2膜面積，轉膜時間20 min。電壓依賴性陰離子通道1(voltage－dependent anion channel 1，VDAC1)轉膜條件為恒流 2 mA/cm2膜面積，轉膜時間 45 min。50 g/L脫脂奶粉封閉后加Ⅰ抗，Ⅰ抗孵育濃度為Trx2(1∶500)，VDAC1(1∶800)，孵育條件為 4 ℃ 過夜。以VDAC1作為內參照[7]。洗膜后加Ⅱ抗室溫孵育2 h，PBST洗膜5 min×6次，用ECL顯色并分析。

3.3 免疫組織化學法檢測FADD的表達 采用免疫組化SP法，石蠟標本切片后常規脫蠟至水，抗原修復后滴加3%H2O2消除過氧化物酶。正常山羊血清封閉37℃15 min后，將FADDⅠ抗以1∶50稀釋，4℃孵育過夜;復溫20分鐘，PBS浸洗。Ⅱ抗37℃孵育20 min，PBS浸洗;Ⅲ抗37℃孵育20 min，PBS洗5 min，3次。DAB顯色，蘇木素襯染，封片。設置對照組，用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照，其它步驟相同。光學顯微鏡進行圖片分析。結果判定:以細胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性判斷標準。每張切片觀察3個高倍(×400)視野，每個視野連續數100個細胞，其中陽性細胞數與總細胞百分比即為陽性細胞指數。

4 統計學處理

結 果

1 低硒大鼠心肌線粒體Trx2蛋白表達結果

NC組大鼠在20周、30周及40周時，其心肌線粒體Trx2蛋白的表達水平無明顯變化(P＞0.05);LS組20周時其心肌線粒體Trx2蛋白的表達水平已明顯低于相應時段NC組大鼠，隨著喂養時間延長，該組大鼠心肌線粒體Trx2蛋白表達的降低程度更為明顯，經統計學分析，30周時明顯低于相應時點NC組，亦明顯低于20周的LS組，40周時明顯低于相應時點NC組，亦明顯低于20周及30周的LS組(均P＜0.05)，見圖 1。

2 在體心功能檢測結果

如表1所示，低硒喂養20周時，LVSP及+dp/dtmax已出現明顯降低，而 LVEDP及－dp/dtmax與NC組比較無明顯差異。30周、40周時，LS組收縮功能與舒張功能均較NC組減低;LS組隨低硒喂養時間延長，LVSP及+dp/dtmax減低更為明顯，30周 與20周、40周與30周及40周與20周 組間兩兩比較，差異均顯著 (P＜0.05)。

Figure1.The expression level of Trx2 protein at different time points.NC:normal control;LS:low selenium;VDAC1:voltage－dependent anion channel 1，as an internal control..n=6.*P＜0.05 vs NC group at the same time point;△P ＜0.05 vs LS group at 20 weeks;#P ＜0.05 vs LS group at 30 weeks.圖1 不同時點Trx2蛋白的表達水平

表1 不同喂養時間大鼠在體心功能測定結果Table 1.The results of in vivo cardiac function of rats at different time points(.n=6)

表1 不同喂養時間大鼠在體心功能測定結果Table 1.The results of in vivo cardiac function of rats at different time points(.n=6)

NC:normal control;LS:low selenium.*P ＜0.05 vs NC group at the same time point;△P ＜0.05 vs LS group at 20 weeks;#P ＜0.05 vs LS group at 30 weeks.

Time(week) Group LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) －dp/dtmax(mmHg/s)20 NC 130.30 ±3.72 －1.38 ±0.33 10430.00 ±808.567645.60 ±962.46 LS 113.30 ±2.21* －2.72 ±2.07 7366.10 ±455.61* 6851.03 ±654.3430 NC 118.97 ±5.31 1.43 ±2.51 8582.62 ±621.14 6255.50 ±728.67 LS 103.82 ±5.24＊△ －2.82 ±1.63* 6160.68 ±402.17＊△ 4982.80 ±613.21*40 NC 120.08 ±3.29 －0.92 ±1.59 8295.88 ±1318.29 6523.60 ±708.93 LS 97.74 ±2.87＊△# －2.88 ±1.18* 5381.21 ±646.72＊△# 3863.32 ±348.00*

3 心肌細胞凋亡情況的免疫組化結果

采用SP法染色，細胞內出現棕色顆粒視為凋亡陽性細胞。由圖2可見，NC組棕色細胞較少，而LS組棕色細胞較多。經統計學分析，NC組間對比未見明顯差異(P＞0.05)，LS組與相應時段NC組相比，差異均顯著;LS各組間(30周與20周、40周與30周、40周與20周)相比，均有顯著差異(P＜0.05)。

4 Trx2與心功能及心肌細胞凋亡指數之間的相關性分析

K－S法正態性檢驗顯示，Trx2、LVSP和+dp/dtmax的P值均大于0.05，可視為近似正態分布資料，而心肌細胞凋亡指數數據為偏態分布。相關性分析結果為，Trx2與 LVSP的相關系數為0.872(P＜0.01)，見圖 3;Trx2與 +dp/dtmax的相關系數為0.822(P＜0.01)，見圖4。Trx2與凋亡細胞指數的相關系數為 －0.858(P ＜0.01)，見圖5。

討 論

Figure2.The immunohistochemical results of apoptosis of myocardial cells in rats at different time points(SP，×400).NC:normal control;LS:low selenium..n=6.*P ＜ 0.05 vs NC group at the same time point;△P ＜0.05 vs LS group at 20 weeks;#P ＜0.05 vs LS group at 30 weeks.圖2 不同時間點大鼠心肌組織中細胞凋亡免疫組化染色結果

Figure3.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and LVSP of rats.圖3 大鼠心肌線粒體Trx2表達量與LVSP的相關性

Figure4.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and+dp/dtmaxof rats.圖4 大鼠心肌線粒體Trx2表達量與+dp/dtmax的相關性

Figure5.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and apoptotic index of myocardial cells in rats.圖5 大鼠心肌線粒體Trx2表達量與心肌細胞凋亡指數的相關性

Trx2的基本功能為抗氧化應激和抗凋亡作用，為了解Trx2在心肌細胞線粒體表達的動態變化及其對心肌細胞損傷的影響，本實驗在前期低硒大鼠蛋白質組學研究的基礎上，完成了低硒大鼠心肌線粒體中Trx2表達的動態變化及其在心肌細胞損傷中的作用研究，并對Trx2抗凋亡機制進行初步探討。

張在香等[8]在觀察低硒大鼠不同組織硒蛋白利用硒的優先性研究中，發現20周后才能明確觀察到低硒對硒敏感蛋白的影響，其低硒大鼠造模時間為20周，為此，本研究參照該研究，從低硒喂養20周開始觀察。在我們的研究中，大鼠低硒喂養20周時，與NC組相比，其Trx2蛋白表達已出現明顯降低。隨著喂養時間的延長，Trx2表達降低更明顯。這與滕宗艷等[6]的研究結果相一致，他們低硒喂養大鼠14周，冰泳刺激5 min后用Western blotting法測大鼠心肌TrxR及Trx表達，發現常硒冰泳組TrxR及Trx蛋白表達增高。與常硒組相比，低硒冰泳組TrxR及Trx蛋白表達降低而血中脂質過氧化物含量增高。因此他們認為低硒條件下心肌Trx系統功能降低，遇到冰泳負荷時心肌不能及時清除過剩的自由基及修復損傷的蛋白，使心肌易受損傷。蔡成等[9]研究了Trx2對高氧肺損傷線粒體的保護作用，發現人肺腺癌A549細胞在高氧環境暴露48 h后，細胞線粒體中Trx2的mRNA表達和蛋白表達均減弱，A549細胞出現凋亡甚至損傷致死。這種變化表明Trx2表達減弱時對高氧肺損傷的線粒體的保護作用亦減弱。張超英等[10]對低硒與大鼠心肌組織脂質過氧化及心肌細胞損傷關系的研究顯示，在12周時低硒組大鼠心肌組織中脂質過氧化產物丙二醛較加硒組顯著為高，低硒組心肌凋亡細胞檢出率為87.5%也明顯高于加硒組(檢出率25.0%)。在本實驗中，低硒組大鼠心臟收縮及舒張功能均降低，心肌細胞出現明顯凋亡，而Trx2的表達量與LVSP和+dp/dtmax呈正相關，與心肌細胞凋亡指數呈負相關(P＜0.01)。

根據已有研究，分析本實驗Trx2表達下降的原因可能為:(1)線粒體通過氧化磷酸化過程為細胞提供ATP的同時產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，是生理狀態下ROS產生的主要來源。低硒時含硒酶及有關蛋白合成減少，ROS清除不足，線粒體功能受損，ATP供應不足，導致Trx2蛋白合成減少;(2)氧化應激等因素可使氧化型Trx2增加，氧化型的Trx2更易被降解。Zhang等[11]研究認為氧化型的Trx2的降解可能由線粒體基質內Lon蛋白酶執行的，Lon蛋白酶是2002年才被發現的位于線粒體基質負責蛋白質量控制的酶，它的作用是把體內損壞的蛋白質分解并清除掉。Trx2的降解使線粒體抗氧化系統的主要蛋白Trx2減少，其結果導致細胞氧化損傷進一步加重，如此形成惡性循環。對于Trx2抗凋亡機制，Tanaka等[11]的實驗顯示Trx2與細胞色素C(cytochrome C，CytC)發生了免疫共沉淀反應，認為Trx2通過與線粒體基質中的促凋亡蛋白CytC錨定，二者形成復合物，通過抑制凋亡信號的傳遞而抑制細胞凋亡。而Trx2是否與CytC結合發揮抗凋亡作用尚有爭議，還需進一步研究。

目前針對Trx2的研究大多數是從組織或細胞水平提取該蛋白來進行的，由于Trx2僅特異性表達于線粒體，為避免細胞內其它非特異性蛋白的干擾，提高樣品蛋白中Trx2的豐度，使所得結果更加可靠，本研究首次采用了先純化心肌線粒體，在此基礎上提取線粒體蛋白來進行相關指標的測定，實踐證明該方法是可行且可靠的。

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