IGFBP7對人乳腺癌MCF－7細胞增殖的影響及其機制*

袁 磊，左曙光，范文娟，宋國華

(漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002)

胰島素樣生長因子結合蛋白(insulin－like growth factor binding proteins，IGFBPs)是一個能夠與胰島素樣生長因子(insulin－like growth factor，IGF)結合的蛋白質家族。根據與IGF親和力的高低可將IGFBP超家族分成兩類:高親和力IGFBPs(IGFBP1～6)和低親和力 IGFBPs(IGFBP7 ～ 10)[1]。與高親和力IGFBPs相比，低親和力IGFBPs與IGFs的親和力低5～25倍，這提示低親和力IGFBPs可能發揮一些與IGFBP家族其它成員不同的生物學作用。IGFBP7 是第一個被證實的低親和力 IGFBPs[2－3]。IGFBP7在正常人體多種組織、器官中廣泛表達，如心臟、脾臟、小腸、大腸、卵巢、乳腺等，然而在多種腫瘤組織中卻表達下調甚至缺失，如黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等。IGFBP7在正常乳腺導管和小葉上皮細胞均有表達[4]，在衰老的乳腺上皮細胞中過表達(可達正常水平的10倍)[5]，但在乳腺癌組織中表達下降[6]，并且癌組織的侵襲力和惡性程度越高其表達越低[7]。因此IGFBP7可作為特異性標志物用于乳腺腫瘤的病理學和血清學診斷。大量研究表明，IGFBP7可抑制多種腫瘤組織的生長，促進腫瘤細胞的衰老和凋亡。本研究通過構建穩定表達IGFBP7的人乳腺癌MCF－7細胞，探究IGFBP7對人乳腺癌MCF－7細胞增殖的影響及其分子生物學機制。

材料和方法

1 動物

MCF－7細胞購自中國科學院細胞庫，大腸桿菌菌株DH5α由學校分子醫學實驗中心提供。

2 主要試劑

胎牛血清和RPMI－1640培養基購自Gibco;質粒pCMV6－IGFBP7購自OriGene;質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自北京天根公司;限制性核酸內切酶Sgf I和Not I購自大連寶生物公司;Effectene轉染試劑盒購自Qiagen;兔抗人IGFBP7、細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal－regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)、p － ERK1/2、細胞周期素(cyclin)D1、cyclin E、細胞周期素依賴性激酶(cyclindependent kinase，CDK)2、CDK4、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53、Rb、p－Rb抗體和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔 IgG購自 Sigma;ECL顯色試劑盒購自上海漢恒公司。

3 主要方法

3.1 質粒pCMV6－IGFBP7的酶切鑒定及空質粒制備 以DH5α大腸桿菌制備感受態細胞，轉化質粒pCMV6－IGFBP7，37℃過夜，挑取單菌落，置于含有氨芐青霉素(ampicillin，AMP)的 LB培養基中，37℃、200 r/min過夜。采用質粒提取試劑盒提取質粒pCMV6－IGFBP7。將質粒pCMV6－IGFBP7于37℃由限制性核酸內切酶Sgf I和Not I酶切過夜，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用DNA純化試劑盒回收瓊脂糖凝膠中pCMV6質粒片段，先用T4 DNA聚合酶將質粒片段末端平滑化，再經T4連接酶連接后即為空質粒pCMV6。

3.2 MCF－7細胞培養 用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養MCF－7細胞，每隔48 h更換1次細胞培養液。待MCF－7細胞覆蓋瓶底達80%以上時，用0.125%胰蛋白酶消化傳代。實驗前更換為不含胎牛血清的RPMI－1640培養基繼續培養24 h。

3.3 構建穩定表達IGFBP7的MCF－7細胞系 采用Effectene轉染試劑盒將質粒pCMV6－IGFBP7和空質粒pCMV6分別轉染入MCF－7細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中培養6 h后用PBS洗去轉染試劑，加入新鮮的培養基和G418(終濃度為0.5 g/L)，繼續培養2周，即可獲得穩定轉染子。

3.4 實驗分組 實驗分成4組，每組5個孔。Control組:正常培養的MCF－7細胞;empty組:穩定轉染空質粒pCMV6的MCF－7細胞;IGFBP7組:穩定轉染質粒 pCMV6－IGFBP7的 MCF－7細胞;PD98059組:經 PD98059(終濃度為10 μmol/L)作用72 h的MCF－7細胞。

3.5 軟瓊脂克隆形成實驗 將1.2%低熔點瓊脂糖與細胞培養基以1∶1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，注入6孔板中，每個孔1.4 mL，溫室凝固備用。將細胞經胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，調整細胞濃度至1×107/L。將0.6%低熔點瓊脂糖與細胞培養基以1∶1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，向每孔加1 mL上層瓊脂和50 μL單細胞懸液(500 cells/well)，混勻，室溫凝固。置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養3周，計數直徑大于100 μm的克隆，計算克隆形成率(colony－forming efficiency，CFE)，CFE(%)=克隆數/接種數 ×100%。

3.6 細胞周期檢測 制備各實驗組細胞懸液，用冷PBS洗滌細胞2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4℃固定24 h，離心去除乙醇，再用冷PBS洗滌細胞2次，加入1 mL PI溶液(50 mg/L)，4℃避光染色30 min，送流式細胞儀檢測。

3.7 Western blotting 裂解各組細胞提取總蛋白。用Bradford法測定蛋白濃度。將總蛋白經SDSPAGE分離后轉移至PVDF膜。將PVDF膜移入含有封閉液(5%脫脂奶粉)的平皿中，室溫下封閉1 h后，分別加入Ⅰ抗(兔抗人 IGFBP7、ERK1/2、p－ERK1/2、 cyclin D1、 CDK4、 cyclin E、 CDK2、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53、Rb 和 p － Rb 抗體)，4 ℃ 過夜。加入Ⅱ抗(HRP標記的山羊抗兔IgG)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL顯色液顯色。運用ImageJ軟件測定條帶灰度值，以p－Rb、p－ERK1/2條帶分別與Rb、ERK1/2條帶的灰度值之比衡量其的磷酸化水平，以 IGFBP7、cyclin D1、CDK4、cyclin E、CDK2、p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53 和 Rb 條帶分別與內參照蛋白β－actin條帶的灰度值之比代表其蛋白表達水平。

4 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 酶切質粒pCMV6－IGFBP7及制備空質粒

質粒pCMV6－IGFBP7經Sgf I和Not I酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像系統檢測顯示，質粒pCMV6－IGFBP7長度為6 kb。酶切產生的pCMV6質粒片段和IGFBP7片段長度分別為4.9 kb和1.1 kb，與預期結果一致。空質粒為4.9 kb，見圖1。

Figure1.Restriction endonuclease digestion of pCMV6－IGFBP7 and empty plasmid pCMV6.M:marker;A:pCMV6－IGFBP7;B:pCMV6－IGFBP7 digested by Sgf I and Not I;C:empty plasmid pCMV6.圖1 質粒pCMV6－IGFBP7酶切結果與空質粒pCMV6

2 IGFBP7的表達

Western blotting結果顯示，control組、empty組和PD98059組均不表達IGFBP7蛋白，穩定轉染pCMV6－IGFBP7質粒的IGFBP7組MCF－7細胞高表達IGFBP7蛋白，表明穩定表達IGFBP7蛋白的細胞系構建成功，見圖2。

Figure2.Expression of IGFBP7 protein in different groups.圖2 IGFBP7蛋白在各實驗組中的表達

3 軟瓊脂克隆形成實驗

IGFBP7組細胞的CFE為2.92% ±0.36%，均顯著低于其它各組(P＜0.01)。PD98059組細胞的CFE為7.56% ±0.69%，顯著低于control組(P＜0.01)。Empty組CFE與control組相比無顯著差異，見圖3。

Figure3.Effect of IGFBP7 on colony－forming efficiency(CFE)of MCF－7 cells..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P＜0.01 vs PD98059 group.圖3 IGFBP7對人乳腺癌MCF－7細胞克隆形成率的影響

4 IGFBP7對細胞周期的影響

IGFBP7組G0/G1期細胞比例為77.69% ±2.17%，顯著高于其它各組(P＜0.01)，S期和G2/M細胞比例分別為13.66%±1.18%和8.65%±0.99%，均顯著低于其它各組(P＜0.01)。PD98059組G0/G1期細胞比例為66.03% ±2.04%，顯著高于control組(P＜0.01)，但明顯低于IGFBP7組(P＜0.01)，S期和 G2/M細胞比例分別為16.60% ±0.92%和17.37% ±1.12%，均顯著低于 control組(P＜0.05)。Empty組G0/G1期、S期和G2/M細胞比例與control組相比無顯著差異，見圖4。

5 IGFBP7對ERK磷酸化的影響

PD98059組p－ERK1/2與ERK1/2灰度比為0.0710±0.0059，均顯著低于其它各組(P＜0.01)。IGFBP7組p－ERK1/2與ERK1/2灰度比為0.2162±0.0168，明顯低于 control組，見圖5。

Figure4.Effect of IGFBP7 on cell cycle of MCF－7 cells measured by flow cytometry..n=5.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P＜0.01 vs PD98059 group.圖4 IGFBP7對人乳腺癌MCF－7細胞周期的影響

6 IGFBP7 對 cyclin D1、CDK4、cyclin E、CDK2、p27KIP1、p21CIP1/WAF1、p53、Rb 和 p －Rb 蛋白表達的影響

IGFBP7組 cyclin D1/β－actin的灰度比為0.4518±0.0267，顯著低于 control組(P ＜0.01)，但與PD98059組相比無顯著差異，cyclin E/β－actin和p－Rb/Rb的灰度比分別為 0.4006±0.0161和0.1512±0.0095，顯著低于其它各組(P＜0.01)，p27KIP1/β －actin、p21CIP1/WAF1/β －actin 和 p53/β －actin的灰度比分別為 0.8744±0.0317、0.9229±0.0316和0.9481±0.0341，顯著高于其它各組(P＜0.01)。PD98059組 p27KIP1/β－actin的灰度比為0.7332±0.0301，顯著高于control組(P ＜0.01)，p－Rb/Rb的灰度比為0.3315±0.0194，顯著低于control組(P ＜0.01)，cyclin E/β －actin的灰度比為0.8924±0.0304，與 control組相比無顯著差異。Control組與empty組相比無顯著差異。各組CDK4/β －actin、CDK2/β －actin和 Rb/β －actin的灰度比無顯著差異，見圖6、7。

Figure5.IGFBP7 and PD98059 decreased the phosphorylation of ERK1/2..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P ＜0.01 vs PD98059 group.圖5 IGFBP7和PD98059抑制ERK1/2的磷酸化

Figure6.Effects of IGFBP7 on expression of cyclin D1，CDK4，cyclin E and CDK2 in MCF－7 cells..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P ＜0.01 vs PD98059 group.圖6 IGFBP7對cyclin D1、CDK4、cyclin E和CDK2蛋白表達的影響

討 論

RAS/RAF/MEK/ERK信號通路參與細胞增殖與分化、細胞形態維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡和細胞惡變等多種生物學反應，是涉及調節細胞生長、分化及分裂信號網絡的核心。大量來自生長因子、絲裂原、環境刺激等信號可激活 RAS/RAF/MEK/ERK信號通路，通過信號級聯反應作用于核轉錄因子如AP－1、NF－кB等，調控基因表達。在許多人類的癌癥(如口腔癌、黑色素瘤、乳腺癌等)中都可發現ERK1/2信號通路的過度激活[8－9]。本研究結果顯示，人乳腺癌MCF－7細胞ERK1/2信號通路處于顯著活化狀態，而高表達IGFBP7可明顯抑制ERK1/2磷酸化，這可能與IGFBP7上調RAF激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein，RKIP)有關[10]。

細胞增殖是通過細胞周期來完成的。細胞周期是多因子參與的高度精確和有組織的時序調控過程。細胞周期素(cyclins)、細胞周期素依賴性激酶(cyclin－dependent kinases，CDKs)和細胞周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin－dependent kinase inhibitors，CDKIs)是細胞周期調控中的關鍵組分。Cyclin D1和cyclin E屬細胞周期素家族成員，可分別與CDK4和CDK2結合并激活其活性，調控細胞由G1期至S期的轉變。Rb是cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2激酶的一種重要底物。高度磷酸化的Rb與E2F轉錄因子解離，使E2F得以活化，從而激活一系列下游事件，其中包括DNA的復制，使細胞從G1期進入S期。CDKIs根據結構和功能分為INK4家族和CIP/KIP家族。p21CIP1/WAF1和p27KIP1是CIP/KIP家族中的重要成員，它們可與G1/S期激酶復合物如cyclin D/CDK4和cyclin E/CDK2等緊密結合，抑制其活性，阻止細胞從 G1期進入 S期，過表達 p21CIP1/WAF1和p27KIP1均可使細胞停滯于 G1期[11－12]。

本研究發現，IGFBP7過表達既可顯著抑制人乳腺癌MCF－7細胞cyclin D1和cyclin E的表達，又同時促進人乳腺癌 MCF－7細胞 p21CIP1/WAF1和p27KIP1蛋白表達，這樣不僅可以減少cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2激酶復合物的形成，還能有效抑制已形成的cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2激酶復合物的活性，從而抑制了Rb磷酸化和E2F活化，最終阻止人乳腺癌MCF－7細胞從G1期進入S期。

Figure7.Effects of IGFBP7 on expression of p21CIP1/WAF1，p27KIP1，p53，Rb and p－Rb in MCF－7 cells..n=5.△△P＜0.01 vs control and empty groups;##P ＜0.01 vs PD98059 group.圖7 IGFBP7對p21CIP1/WAF1、p27KIP1、p53、Rb和p－Rb蛋白表達的影響

本研究還發現，IGFBP7過表達可顯著抑制ERK1/2信號通路的活化。為了探究ERK1/2信號通路是否參與了IGFBP7的細胞周期阻滯作用，在本研究中我們使用了MEK1/2抑制劑PD98059以觀察ERK1/2信號通路對MCF－7細胞增殖的影響。結果發現，PD98059誘導了一些與IGFBP7相似的作用，如阻滯MCF－7細胞于G1期，下調cyclin D1和上調p27KIP1的表達。這提示IGFBP7可能是通過抑制ERK1/2信號通路的活化影響cyclin D1和p27KIP1的表達，然而IGFBP7對p21CIP1/WAF1和cyclin E的表達調控似乎與ERK1/2信號通路無關。

為了進一步探究IGFBP7對p21CIP1/WAF1的表達調控機制，我們觀察了IGFBP7對p21CIP1/WAF1上游基因p53的表達影響。結果發現，IGFBP7可上調p53的表達。這提示IGFBP7可能是通過上調p53的表達進而促進p21CIP1/WAF1的表達。但IGFBP7對于cyclin E的調控機制目前尚不清楚，尚不排除IGFBP7作為轉錄調節因子直接調控cyclin E表達的可能。

綜上所述，IGFBP7抑制人乳腺癌MCF－7細胞增殖的機制可能與其抑制ERK1/2信號通路，上調p53、p21CIP1/WAF1和 p27KIP1，下調 cyclin D1 和 cyclin E表達，抑制Rb磷酸化有關，但其具體機制還有待進一步的探討。

[1]Kim HS，Nagalla SR，Oh Y.Identification of a family of low－affinity insulin－like growth factor binding proteins(IGFBPs):characterization of connective tissue growth factor as a member of the IGFBP superfamily[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1997，94(24):12981 －12986.

[2]Akaogi K，Sato J，Okabe Y.Synergistic growth stimulation of mouse fibroblasts by tumor－derived adhesion factor with insulin － like growth factors and insulin[J].Cell Growth Differ，1996，7(12):1671 －1677.

[3]Oh Y，Nagalla SR，Yamanaka Y.Synthesis and charac-terization of insulin－like growth factor－binding protein(IGFBP)－7.Recombinant human mac25 protein specifically binds IGF － I and － II[J].Biol Chem，1996，271(48):30322－30325.

[4]Burger AM，Zhang X，Li H.Down－regulation of T1A12/mac25，a novel insulin－like growth factor binding protein related gene，is associated with disease progression in breast carcinomas[J].Oncogene，1998，16(19):2459－2467.

[5]Burger AM，Leyland－Jones B，Banerjee K.Essential roles of IGFBP －3 and IGFBP － rP1 in breast cancer[J].Eur J Cancer，2005，41(11):1515 －1527.

[6]Seth A，Kitching R，Landberg G.Gene expression profiling of ductal carcinomas in situ and invasive breast tumors[J].Anticancer Res，2003，23(3A):2043 －2051.

[7]Ivan B，Florence L，Sengul T.Molecular profiling of inflammatory breast cancer:identification of a poor－prognosis gene expression signature[J].Clin Cancer Res，2004，10(20):6789－6795.

[8]Davies H，Bignell GR，Cox C.Mutations of the BRAF gene in human cancer[J].Nature，2002，417(6892):949－954.

[9]von Lintig FC，Dreilinger AD，Varki NM，et al.Ras activation in human breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat，2000，62(1):51 －62.

[10]Wajapeyee N，Serra RW，Zhu X.Oncogenic BRAF induces senescence and apoptosis through pathways mediated by the secreted protein IGFBP7[J].Cell，2008，132(3):363－374.

[11]Harper JW，Elledge SJ，Keyomarsi K.Inhibition of cyclin－ dependent kinases by p21[J].Mol Biol Cell，1995，6(4):387－400.

[12]Toyoshima H，Hunter T.p27，a novel inhibitor of G1 cyclin － Cdk protein kinase activity，is related to p21[J].Cell，1994，78(1):67 －74.