肥胖引起的線粒體功能及抗氧化異常促進小鼠卵母細胞排卵后老化*

李俐琳，任 姿，曾海濤，方 叢

(1中山大學附屬第六醫院生殖醫學中心，廣東 廣州 510000;2廣東省人民醫院生殖醫學中心，廣東 廣州 510080，3中山大學附屬第三醫院婦產科，廣東 廣州 510630)

隨著生活水平的提高及生活方式的改變，全球肥胖癥發生率迅速增加，并呈年輕化趨勢。肥胖在多個方面影響著人類的生殖健康[1－2]。多數肥胖婦女存在與排卵異常相關的不孕癥。另一方面，肥胖患者卵子內的物質和能量代謝也出現異常改變，對卵子質量產生不利影響。即使是進行輔助生育治療的人群，肥胖患者促排卵時間、促性腺激素的使用量及因反應不良的周期取消率均增加，而獲卵數目減少，此外肥胖可增加流產及多種產科合并癥的發病率 [1－2]。

排卵后不及時受精，卵母細胞的生理生化反應活性將顯著降低，這一現象稱為卵母細胞的老化。卵母細胞老化表現為細胞內鈣離子平衡失調、皮質顆粒外排、微管丟失、染色體不對稱和松散分布、線粒體膜電位降低和基質膨脹等變化，是胚胎發育能力低下和早期流產的主要原因之一[3]。肥胖引起組織細胞代謝紊亂[4]，導致ATP生成減少，機體活性氧類(reactive oxygen species，ROS)產生過多和(或)機體抗氧化能力下降，谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平降低;ROS清除不足，導致ROS在體內增多并引起細胞氧化損傷的病理過程。這些提示肥胖患者卵母細胞存在能量和ROS代謝異常，導致排卵后卵母細胞老化加速，引起受孕能力減低，流產率增高[5]。本實驗旨在研究肥胖對小鼠卵母細胞體內老化、體外受精和胚胎發育的影響及可能機制。

材料和方法

1 動物及主要試劑

動物DBA雄鼠和C57BL/6雌鼠購自北京實驗動物中心，B6D2F1(C57BL/6*DBA)小鼠在本實驗室繁殖獲得。14周大小B6D2F1雌鼠隨機分成2組，正常組給予普通飼料喂養，實驗組每天自由采食高脂飼料[6]，肥胖小鼠建模成功標準為:與正常飼養對照組比較，體重增加大于20%被認為營養性肥胖模型建立成功。孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)購自寧波制藥廠，2'，7'－ 二氯二氫熒光素二乙酸酯(2'，7'－ dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH －DA)購自 Molecular Probe，ATP和GSH檢測試劑盒購自Promega，細胞凋亡與壞死檢測試劑盒購自碧云天，其它試劑購自Sigma。采用HEPES－CZB液收集卵母細胞，CZB－G培養液進行體外培養。采用Vitro Research Media series(Cook Medical)進行體外受精和胚胎培養。

2 卵母細胞的收集及體外培養

B6D2F1雌鼠每只腹腔注射10 IU PMSG，48 h后腹腔注射10 IU HCG。分別于注射HCG 14、18和22 h后后斷頸處死小鼠，收集輸卵管中卵母細胞－卵丘顆粒細胞復合體。

3 卵丘顆粒細胞凋亡的檢測

采用Hoechst 33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染的方法。實驗按照試劑盒說明書進行，使用LSM－510激光共聚焦顯微鏡進行檢測。

4 卵母細胞線粒體膜電位和ROS的檢測

采用線粒體膜電位檢測試劑盒(四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物，5，5'，6，6'－ tetrachloro － 1，1'，3，3'－ tetraethyl benzimidalyl carbocyanine iodide，JC－1)檢查卵母細胞的線粒體膜電位。JC－1用DMSO溶解成1 mmol/L分裝－20℃凍存，去除顆粒細胞的卵母細胞在37℃含1 μmol/L JC－1的培養液中培養15 min后進行檢測。采用LSM－510激光共聚焦顯微鏡檢測，紅色熒光強度/綠色熒光強度的比值反映出線粒體的活性。去除顆粒細胞的卵母細胞在37℃、含10 μmol/L DCFH－DA的培養液中培養30 min后檢測細胞中ROS水平。

5 卵母細胞ATP和GSH含量的檢測

采用透明質酸酶去除顆粒細胞后，使用PBS收集卵母細胞，10 個卵母細胞∶10 μL PBS、50 個卵母細胞∶10 μL PBS分別用于檢測卵母細胞中ATP和GSH水平，液氮中迅速冷凍后置于－80℃凍存。檢測按照試劑盒說明書進行。

6 體外受精和胚胎培養

將成熟卵母細胞放入受精培養液中受精，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養6 h后，采用DAPI染色，如觀察到有2個原核形成，并在卵周隙可看到1條精子尾，認為是正常受精。將正常受精卵再沖洗3次，移入用礦物油覆蓋的、已平衡的20 μL胚胎培養液培養5 d，于第1 d和第5 d分別觀察卵裂和囊胚形成。

7 統計學處理

實驗重復3次，采用SPSS 11.0軟件包進行統計學分析，數據以均數±標準差()表示，組間差異采用方差分析及卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肥胖對排卵后卵丘顆粒細胞凋亡的影響

表1和圖1A～F顯示，注射HCG后，對照組和肥胖者的卵丘顆粒細胞的凋亡率無差別(P＞0.05);注射HCG后18 h較注射HCG后14 h，2組卵丘顆粒細胞的凋亡率顯著增加(P＜0.05)，其中肥胖組小鼠較對照組卵丘顆粒細胞的凋亡率增加顯著(P＜0.05);注射HCG后22 h較注射HCG后18 h，2組卵丘顆粒細胞的凋亡率均顯著增加(P＜0.05)，其中肥胖組小鼠較對照組卵丘顆粒細胞的凋亡率增加更加明顯(P＜0.05)，幾乎達到后者的2倍。

表1 肥胖對排卵后卵丘顆粒細胞凋亡的影響Table1.The effect of obesity on the apoptosis of postovulatory cumulus cells(.n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs the same group at 14 h;△P＜0.05 vs the same group at 18 h.

Time(h) Group Apoptotic rate(%)14 Control 5.53 ±0.97 Obesity 6.91 ±1.0318 Control 7.19 ±1.72#Obesity 10.84 ±2.89*#22 Control 11.37 ±2.79△Obesity 18.50 ±3.86＊△

Figure1.Detection of apoptosis of cumulus cells，and mitochondrial membrane potential(MMP)and reactive oxygen species(ROS)levels in oocytes.A ～F:the cumulus－oocyte complexes(COCs)were stained by Hoechst 33342 and propidium iodide(PI).Cells with intact membrane fluoresced blue，whereas those with damaged membrane fluoresced red.G ～L:the potential－sensitive fluorescence dye JC－1 was used to measure the MMP.High MMP showed yellow－red fluorescence and the low one showed green fluorescence.M ～R:the COCs were stained by DCFH－DA for the ROS assay.圖1 卵丘顆粒細胞凋亡、卵母細胞中線粒體膜電位和ROS水平的檢測

2 肥胖對排卵后卵母細胞線粒體功能的影響

表2和圖1G～L顯示，注射HCG后14 h，卵母細胞線粒體膜電位及ATP含量在對照組和肥胖組均無顯著差異(P＞0.05);注射HCG后18 h較注射HCG后14 h，2組卵母細胞線粒體膜電位無差別，但肥胖組卵母細胞中ATP含量顯著降低(P＜0.05)，其中肥胖組小鼠卵母細胞中ATP含量顯著低于對照組(P＜0.05);注射HCG后22 h較注射HCG后18 h，2組卵母細胞線粒體膜電位及ATP含量均進一步顯著降低(P＜0.05)，其中肥胖組小鼠較對照組卵母細胞線粒體膜電位及ATP含量下降更加明顯(P＜0.05)。

表2 肥胖對排卵后老化卵母細胞線粒體膜電位及ATP含量的影響Table2.The effect of obesity on mitochondrial membrane potential(MMP)and ATP content in postovulatory aging mouse oocytes(.n=3)

表2 肥胖對排卵后老化卵母細胞線粒體膜電位及ATP含量的影響Table2.The effect of obesity on mitochondrial membrane potential(MMP)and ATP content in postovulatory aging mouse oocytes(.n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs the same group at 14 h;△P ＜0.05 vs the same group at 18 h.

Time(h)Group MMP(red fluorescence/green fluorescence)ATP content(pmol/cell)14 Control 0.47 ±0.09 1.13 ±0.27 Obesity 0.44 ±0.12 1.17 ±0.2518 Control 0.48 ±0.11 1.16 ±0.22 Obesity 0.43 ±0.13 1.04 ±0.19*#22 Control 0.42 ±0.11△ 0.92 ±0.19△Obesity 0.35 ±0.12＊△ 0.83 ±0.26＊△

3 肥胖對排卵后卵母細胞ROS和GSH生成的影響

表3和圖1M～R顯示，注射HCG后14 h，對照組和肥胖組ROS水平無差別(P＞0.05)，肥胖組卵母細胞中GSH的水平顯著低于對照組(P＜0.05);注射HCG后18 h較注射HCG后14 h，對照組卵母細胞內ROS和GSH的水平無變化，而肥胖組卵母細胞內ROS的水平開始明顯升高(P＜0.05)，GSH的水平顯著降低(P＜0.05);注射HCG后22 h較注射HCG后18 h，2組卵母細胞ROS和GSH的含量均進一步顯著降低(P＜0.05)，其中和對照組比較，肥胖組小鼠卵母細胞ROS的水平升高更加明顯(P＜0.05)，GSH的水平降低更加明顯(P＜0.05)。

4 肥胖對排卵后卵母細胞胚胎發育的影響

表4顯示，注射HCG 14 h后，對照組和肥胖組的二細胞胚胎、囊胚形成率及囊胚細胞數均無顯著差別(P＞0.05);注射HCG后18 h，對照組和肥胖組的二細胞胚胎和囊胚形成率均無顯著差別(P＞0.05)，而肥胖組囊胚的細胞數顯著低于對照組(P＜0.05)，較注射HCG后14 h，肥胖組囊胚的細胞數顯著減少(P＜0.05);注射HCG后22 h，肥胖組囊胚的二細胞胚胎和囊胚形成率顯著低于對照組(P＜0.05)，較注射HCG后18 h，2組卵母細胞二細胞胚胎和囊胚形成率均顯著降低(P＜0.05)。

表3 肥胖對排卵后老化卵母細胞ROS和GSH含量的影響Table3.The effect of obesity on ROS and GSH content in postovulatory aging mouse oocytes(.n=3)

表3 肥胖對排卵后老化卵母細胞ROS和GSH含量的影響Table3.The effect of obesity on ROS and GSH content in postovulatory aging mouse oocytes(.n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs the same group at 14 h;△P ＜0.05 vs the same group at 18 h.

Time(h)Group Relative fluorescenceGSH content intensity of ROS(pmol/cell)14 Control 1.00 ±0.26 1.66 ±0.37 Obesity 1.07 ±0.31 1.47 ±0.41*18 Control 0.97 ±0.29 1.58 ±0.35 Obesity 1.23 ±0.35*# 1.24 ±0.29*#22 Control 1.22 ±0.37△ 1.21 ±0.32△Obesity 1.69 ±0.52＊△ 0.76 ±0.24＊△

表4 肥胖對排卵后老化小鼠卵母細胞胚胎發育的影響Table4.The effect of obesity on embryonic development competence of postovulatory aging mouse oocytes fertilized in vitro(.n=3)

表4 肥胖對排卵后老化小鼠卵母細胞胚胎發育的影響Table4.The effect of obesity on embryonic development competence of postovulatory aging mouse oocytes fertilized in vitro(.n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs the same group at 14 h;△P ＜0.05 vs the same group at 18 h.

TimeGroup Two－cell embryoBlastocystCell number of(h) formation rateblastocyst(%)(%)14 Control 96.1 85.7 61.8 ±8.4 Obesity 92.9 81.1 58.4 ±9.718 Control 94.6 83.9 64.7 ±8.9 Obesity 91.8 80.5 52.5 ±9.2*#22 Control 88.4△ 72.6△ 53.7±7.7△Obesity 76.3＊△ 57.4*49.3±9.5

討 論

營養性肥胖會影響女性生殖功能，降低受孕率。我們的研究表明，營養性肥胖促進小鼠排卵后的卵母細胞老化，卵母細胞受精及卵裂能力下降，其胚胎發育潛能明顯降低，而對剛排卵的卵母細胞的胚胎發育潛能影響較小。這提示可能在體內，卵母細胞排出后，如未在排卵后4 h內受精，其胚胎質量較低，可能是營養性肥胖會影響女性生殖功能的主要原因。小鼠卵母細胞老化后進行體外受精，其受精率和胚胎發育率均降低。其它研究發現豬卵母細胞老化12 h受精率顯著下降，異常受精率增加。對老化的豬卵母細胞核移植發現，激活1～2 h內核膜破裂率下降，囊胚數目減少[8]。小鼠類似的研究也證實了老化卵母細胞核移植后囊胚形成率明顯降低[3，7]。

卵母細胞的老化是一個復雜的生理過程[3]。ROS是有氧代謝的產物，正常情況下ROS的產生和清除保持動態平衡[9]，當這種平衡破壞而ROS過多時，就會影響卵母細胞成熟、受精、胚胎發育和妊娠等一系列生理過程[3]。我們的研究發現肥胖小鼠卵母細胞在體外老化的進程加快，細胞中ROS的水平在HCG注射后18 h就顯著增加，而正常對照小鼠卵母細胞ROS在HCG注射后22 h才明顯增加，而同時小鼠卵母細胞體外受精和胚胎發育潛能顯著下降。其它研究用過氧化物處理新鮮和老化的卵母細胞，結果發現老化卵母細胞表現出高頻率、低振幅的Ca2+波動，較低的受精率和囊胚率以及較高的胚胎碎片比例[3]。新鮮卵母細胞在低濃度H2O2下能加速老化進程[10]。

近年來研究表明線粒體內膜電位的下降，是凋亡發生的早期事件[11]。van Blerkom 等[12]證實，成熟卵的線粒體膜電位與年齡呈負相關，其胚胎發育潛力也隨之降低。我們前期的研究發現未成熟卵的線粒體膜電位低，而成熟卵的線粒體膜電位高，且均勻分布在整個胞質[13]。發育潛能差的胚胎線粒體活性比發育潛能好的低，說明線粒體在卵和胚胎早期發育中起著重要的作用[12，14]。本研究結果顯示，線粒體膜電位與卵母細胞的質量密切相關，與囊胚形成率呈正相關，提示卵母細胞線粒體內膜的完整性影響卵母細胞及胚胎的體外發育潛能。隨著卵母細胞的老化，高濃度的活性氧對線粒體造成損傷，參與ATP代謝的相關基因表達水平下降，降低了產生ATP的能力[12]。我們的實驗也證實，卵母細胞中ROS水平升高的同時，ATP的含量明顯減少，其發育到囊胚的數減少。此外，其它研究還發現卵母細胞中ATP含量的減少會抑制蛋白質合成和其它功能[12]。GSH在卵母細胞中的主要功能是通過巰基基團參與抗氧化作用和抵抗ROS毒害作用來保護卵母細胞[15]。我們的研究也提示GSH濃度的高低對卵母細胞的成熟和受精是非常重要的，卵母細胞成熟期間GSH的積累能提高卵母細胞的胞質成熟質量，保護卵母細胞在受精后的胚胎發育階段免受氧化損傷。

在肥胖誘導機體胰島素抵抗、細胞能量代謝和抗氧化作用中，線粒體對脂肪酸的清除作用至關重要[16]。胞漿脂肪酸水平的進一步升高將導致線粒體功能障礙，同時細胞線粒體密度下降，ATP生成均明顯減少。此外，肥胖患者細胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性下降。SOD作為機體內最廣泛存在的一類金屬抗氧化酶[17]，能催化超氧陰離子自由基的歧化反應。因此細胞清除生命活動中產生的超氧離子的能力下降，ROS水平增加，誘導細胞凋亡。卵丘顆粒細胞是環繞在卵母細胞外的一種特殊體細胞，不僅在卵母細胞成熟、排卵和受精過程中有重要作用，而且對卵母細胞的老化也有影響[3]。我們的研究發現卵丘顆粒細胞在排卵后凋亡率逐漸增加，肥胖促進其凋亡發生。當機體存在肥胖的病理狀態，顆粒細胞出現氧化應激代償能力下降，抗氧化物質GSH等生成減少，同時自身大量的ROS釋放入卵泡液中，嚴重影響了卵子的發育成熟[3]。可以推測，肥胖卵丘顆粒細胞的氧化應激降低了卵子的受精能力，導致了后續胚胎發育不佳。如前所述，顆粒細胞自身狀態對卵子的發育影響較大。在肥胖的異常抗氧化狀態下，顆粒細胞產生的過量ROS可直接導致自身凋亡，使得卵子失去顆粒細胞的保護及其它調節功能，進而損害卵子的發育。因此我們認為顆粒細胞氧化應激可通過凋亡影響卵子質量。除此之外，氧化應激還可能直接損害卵子質量。

本研究結果初步顯示肥胖促進排卵后卵母細胞的老化，氧自由基對卵母細胞的損傷可能是引起母源老化不孕的重要原因。在對肥胖患者進行生殖健康宣教時，應突出在醫生的指導下進行安全而有效的減肥和助孕治療，把握排卵時機，選擇排卵早期進行受精，避免卵子排卵后老化的影響，以提高受孕幾率，減少流產發生。

[1]Moran LJ，Dodd J，Nisenblat V，et al.Obesity and reproductive dysfunction in women[J].Endocrinol Metab Clin North Am，2011，40(4):895－906.

[2]Ogbuji QC.Obesity and reproductive performance in women[J].Afr J Reprod Health，2010，14(3):143 －151.

[3]Miao YL，Kikuchi K，Sun QY，et al.Oocyte aging:cellular and molecular changes，developmental potential and reversal possibility[J].Hum Reprod Update，2009，15(5):573－585.

[4]Lumeng CN，Saltiel AR.Inflammatory links between obesity and metabolic disease[J].J Clin Invest，2011，121(6):2111－2117.

[5]Selesniemi K，Lee HJ，Muhlhauser A，et al.Prevention of maternal aging－associated oocyte aneuploidy and meiotic spindle defects in mice by dietary and genetic strategies[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(30):12319 －12324.

[6]Glendinning JI，Breinager L，Kyrillou E，et al.Differential effects of sucrose and fructose on dietary obesity in four mouse strains[J].Physiol Behav，2010，101(3):331 －343.

[7]張國敏，周崢嶸，孫紅艷，等.哺乳動物卵母細胞老化機制的研究進展[J].家畜生態學報，2012，33(1):9－13.

[8]Iwamoto M，Onishi A，Fuchimoto D，et al.Effects of caffeine treatment on aged porcine oocytes:parthenogenetic activation ability，chromosome condensation and development to the blastocyst stage after somatic cell nuclear transfer[J].Zygote，2005，13(4):335 －345.

[9]吳建宇，王淑秋，王柏欣，等.實驗性2型糖尿病大鼠心肌線粒體的氧自由基損傷[J].中國病理生理雜志，2010，26(2):233－237.

[10]Goud AP，Goud PT，Diamond MP，et al.Reactive oxygen species and oocyte aging:role of superoxide，hydrogen peroxide，and hypochlorous acid[J].Free Radic Biol Med，2008，44(7):1295－1304.

[11]陳夢飛，陸大祥，戚仁斌，等.甘氨酸脂質體對心肌細胞線粒體膜電位及凋亡的影響[J].中國病理生理雜志，2008，24(7):1254－1258.

[12]van Blerkom J.Mitochondrial function in the human oo-cyte and embryo and their role in developmental competence[J].Mitochondrion，2011，11(5):797 －813.

[13]Zeng HT，Yeung WS，Cheung MP，et al.In vitro－matured rat oocytes have low mitochondrial deoxyribonucleic acid and adenosine triphosphate contents and have abnormal mitochondrial redistribution[J].Fertil Steril，2009，91(3):900－907.

[14]Zeng HT，Ren Z，Yeung WS，et al.Low mitochondrial DNA and ATP contents contribute to the absence of birefringent spindle imaged with PolScope in in vitro matured human oocytes[J].Hum Reprod，2007，22(6):1681 －1686.

[15]Hao ZD，Liu S，Wu Y，et al.Abnormal changes in mitochondria，lipid droplets，ATP and glutathione content，and Ca2+release after electro－activation contribute to poor developmental competence of porcine oocyte during in vitro ageing[J].Reprod Fertil Dev，2009，21(2):323 －332.

[16]Fresno M，Alvarez R，Cuesta N.Toll－like receptors，inflammation，metabolism and obesity[J].Arch Physiol Biochem，2011，117(3):151－164.

[17]Guo J，Chen Y，Yuan B，et al.Effects of intracellular superoxide removal at acupoints with TAT－SOD on obesity[J].Free Radic Biol Med，2011，51(12):2185 －2189.