漢防己甲素對人鼻咽癌細胞株的放射增敏作用及其機制*

吳喜福， 張革化△， 黎景佳， 黃健聰， 王 凱，嚴睿成， 鄭 堅， 謝逢安， 葉 進， 劉 賢

(1中山大學附屬第三醫院耳鼻咽喉－頭頸外科，廣東 廣州 510630;暨南大學附屬第一醫院2腫瘤科，3直線加速器室，廣東 廣州 510632)

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma，NPC)是源于鼻咽部上皮的鱗狀細胞癌，因解剖位置隱匿、毗鄰重要器官，治療以放射治療為首選。雖然放療技術的發展明顯提高了早期NPC患者的5年總生存率，但晚期患者療效仍不理想。治療失敗的主要原因之一是放療后腫瘤局部殘留或復發。NPC細胞對放射線抵抗是一個突出的問題，已有研究顯示放射抵抗者高達23.2%[1－2]。同步放化療雖提高了 NPC的療效，但伴隨的毒副反應使患者的依從性下降，5年總生存率仍未獲得明顯改善[3]。因此，如何提高NPC對放射線照射的敏感性成為亟待解決的問題。

研究發現漢防己甲素(tetrandrine，Tet)具有抗腫瘤效應，并能增加腫瘤細胞對放射線照射的敏感性[4]。本研究擬探討 Tet對人鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2是否具有放射增敏作用，并研究其增敏機制，為尋找NPC的放射增敏劑提供理論依據。

材料和方法

1 細胞

人NPC高分化鱗癌細胞株CNE1和低分化鱗癌細胞株CNE2由中山大學腫瘤醫院惠贈。細胞采用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI－1640培養基培養，每2～3 d傳代1次。

2 主要試劑

Tet購于大連富生天然藥物開發有限公司(純度＞98%)，溶液配制方法參考文獻[5]。四甲基偶氮唑鹽[3－(4，5－dimethyl－2－thiazolyl)－2，5－diphenyl－tetrazolium bromide，MTT]購于 Sigma，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于天津市大茂化學試劑廠，細胞周期試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司。

3 細胞照射

采用SIEMENZ直線加速器產生的6 MV的X線照射細胞，劑量率為2.5 Gy/min。照射時在細胞培養板加墊0.5 cm厚的有機玻璃板及硅膠補償膜，放射源至細胞的距離為100 cm，照射野為25 cm×25 cm。

4 主要方法

4.1 細胞增殖抑制實驗

4.1.1 Tet增殖抑制實驗 CNE1和 CNE2細胞分別以每孔1000個接種于96孔板，每組5個平行孔，待細胞貼壁后分別給予 0、1、2、3、4、5、10 和 20 μmol/L Tet溶液培養24 h。終止培養，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續孵育4 h后，吸去孔內上清液并加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后于490 nm波長測定吸光度值，計算Tet的半數抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)。

4.1.2 Tet最大非細胞毒性劑量篩選實驗 CNE1和CNE2細胞分別以每孔1000個接種于96孔板，每組5個平行孔，待細胞貼壁后分別給予0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8 和 2 μmol/L Tet溶液培養，培養24 h后細胞換液。MTT法測定吸光度值，連續檢測6 d，繪制不同Tet劑量下的細胞生長曲線。

4.1.3 Tet聯合放射線照射對細胞增殖抑制實驗設立空白對照組和單純Tet組、單純放射線照射組和Tet聯合放射線照射組。CNE1和CNE2細胞分別以每孔1000個接種于96孔板，每組5個平行孔，待細胞貼壁后單純放射線照射組及Tet聯合放射線照射組給予4 Gy放射線照射，照射結束后，單純Tet組及Tet聯合放射線照射組立即給予最大非細胞毒性劑量的Tet溶液培養，培養24 h后細胞換液。MTT法測定吸光度值，連續檢測6 d，繪制各組的細胞生長曲線。

4.2 克隆形成實驗 操作方法參考文獻[6]，設立單純放射線照射組和Tet聯合放射線照射組。CNE1和 CNE2 細胞分別以 100、200、400、800、2000 和5000個接種于直徑6 cm的培養皿，每組3個平行皿，待細胞貼壁后分別給予 0、1、2、4、6 和 8 Gy放射線照射，照射結束后，Tet聯合放射線照射組立即給予最大非細胞毒性劑量的Tet溶液培養24 h。細胞換液后繼續培養，待10～12 d長出肉眼可見的克隆后，吸去培養基，PBS洗滌、甲醇固定、姬姆薩染色，計算50個細胞以上的克隆數。根據克隆數計算克隆形成率、細胞存活分數，采用單擊多靶模型擬合細胞存活分數曲線及放射生物學參數平均致死劑量(mean lethal dose，Do)、準閾劑量(quasi－field dose，Dq)、2 Gy 細胞存活分數(survival fraction at 2 Gy，SF2)及放射增敏比(senitivity enhancement ratio，SER)。克隆形成率(%)=克隆形成數/接種細胞數×100%。細胞存活分數(%)=某一劑量照射組的克隆數/(該組接種細胞數×PE)×100%。SER=單純放射線照射組Do/Tet聯合放射線照射組Do[7]。

4.3 流式細胞儀檢測細胞周期 設立空白對照組、單純Tet組、單純放射線照射組和Tet聯合放射線照射組。CNE1和CNE2細胞分別以2×105cells/well接種于6孔板，每組3個平行孔，待細胞貼壁后單純放射線照射組及Tet聯合放射線照射組給予4 Gy放射線照射，照射結束后，單純Tet組及Tet聯合放射線照射組立即給予最大非細胞毒性劑量的Tet溶液培養24 h。胰酶消化、收集細胞，PBS洗滌、70%乙醇固定過夜。RNase A 37℃水浴30 min，PI避光染色30 min，流式細胞術檢測細胞周期。

5 統計學處理

結 果

1 細胞增殖抑制實驗

Tet對細胞具有增殖抑制作用，濃度越高增殖抑制作用越明顯，提示其增殖抑制作用具有濃度依賴性;Tet對CNE1和CNE2細胞的IC50分別為(12.44±0.05)μmol/L 和(13.39 ± 0.09)μmol/L，見圖1A。當 Tet分別為 1.5 μmol/L 和 1.8 μmol/L 時，CNE1和CNE2細胞的生長曲線與空白對照組生長曲線相比差異無統計學意義(P＞0.05)，提示該劑量的Tet為最大非細胞毒性劑量，見圖1B、C。

單純放射線照射組與空白對照組相比，細胞增殖受到抑制，差異有統計學意義(P＜0.05)。而Tet聯合放射線照射組與單純放射線照射組相比，最大非細胞毒性劑量的Tet干預使CNE1和CNE2細胞增殖明顯受到抑制，第4～6 d時明顯，2組間差異均有統計學意義(P ＜0.01)，見圖1D、E。

Figure1.Inhibitory effect of Tet on the proliferation of CNE1 and CNE2 cells.A:relative survival after exposure to Tet for 24 h;B and C:the maximum non－cytotoxic dose of Tet;D and E:the inhibitory effect of Tet and radiation on the proliferation..n=3.*P ＜0.05 vs control;▲▲P ＜0.01 vs 4 Gy.圖1 細胞增殖抑制實驗

2 克隆形成實驗

采用單擊多靶模型擬合細胞存活分數曲線并計算放射生物學參數，結果提示CNE1和CNE2細胞的SF2分別為 0.42 ±0.05 和 0.54 ±0.02，見圖 2。CNE1細胞:單純放射線照射組的Do和Dq分別為1.26 ±0.02 Gy和0.93 ±0.12 Gy，Tet聯合放射線照射組Do和Dq分別為(0.73±0.05)Gy和(0.67±0.03)Gy;CNE2細胞:單純放射線照射組的Do和Dq分別為(2.27 ±0.04)Gy 和(1.24 ±0.08)Gy，Tet聯合放射線照射組 Do和 Dq分別為(1.61±0.08)Gy和(1.10 ±0.06)Gy。Tet對 CNE1 和CNE2細胞的 SER分別為1.73和1.40(P ＜0.05)。

3 流式細胞儀檢測細胞周期

空白對照組CNE1和CNE2細胞的G1期細胞比例分別為(65.23 ±9.33)%和(44.47 ±2.55)%，單純Tet組G1期細胞比例分別為(67.39±4.65)%和(51.90 ±8.90)%，G1期細胞比例雖有所升高，但差異并無統計學意義(P＞0.05)?？瞻讓φ战MCNE1和CNE2細胞的 G2期細胞比例分別為(11.41±1.50)%和(14.48±1.80)%，而單純放射線照射組G2期細胞比例分別為(42.62 ±2.07)%和(34.82 ±2.74)%，2組間差異有統計學意義(P＜0.01)。Tet聯合放射線照射組，2株細胞G2期細胞比例分別為(17.02 ±1.87)%和(19.64 ±4.82)%，與單純放射線照射組相比明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖3。

Figure2.Colony formation assay.－Tet:radiation group;+Tet:Tet plus radiation group..n=3.*P＜0.05 vs－Tet.圖2 克隆形成實驗

Figure3.Cell cycle analyzed by flow cytometry..n=3.＊＊P＜0.01 vs control;▲▲P＜0.01 vs 4 Gy.圖3 細胞周期結果

討 論

Tet又名粉防己堿，為千金藤屬植物粉防己塊根中的主要成分，化學結構為雙芐基異喹啉生物堿，分子式為C33H42N2O6。Tet為非選擇性鈣通道拮抗劑，具有降壓、鎮痛、抗炎、抗纖維化、降血糖等作用。近年來研究發現Tet具有抗腫瘤作用，表現為直接抗腫瘤、增加放射敏感性、逆轉腫瘤細胞多重耐藥和抗血管形成[8－10]。已有的研究提示Tet的抗腫瘤作用機制主要通過抑制CDK/cyclin E和CDK4轉導通路、抑制CDK4、CDK6、cyclin D1和E2F1蛋白降解、抑制p53/p21Cip1的表達等途徑，誘導腫瘤細胞阻滯于G1期[5]。

作為一個理想的放射增敏劑(radiation sensitizing agents，RAS)，應該具備如下特點:(1)化學性質穩定、不易和其它物質反應;(2)有效劑量沒有毒性或毒性很低;(3)易溶于水，便于給藥;(4)專對腫瘤細胞，特別是對腫瘤乏氧細胞有較強的放射增敏作用;(5)有較長的生物半衰期，并在體內能保持其藥物毒性，足以滲入整個腫瘤;(6)在常規分次治療，較低的藥物劑量即可有放射增敏作用;而關于抗腫瘤藥物用于增敏研究的劑量選擇，經驗用量為抗腫瘤藥物 IC50的 1/10 ～1/5[11]。

本研究在探討Tet對CNE1和CNE2細胞IC50的基礎上，進一步通過MTT實驗得出Tet對CNE1和CNE2細胞的最大非細胞毒性劑量，分別為1.5 μmol/L 和 1.8 μmol/L，采用此劑量研究 Tet的放射增敏作用較以往的經驗用量更為科學、可信。

已有文獻證實放射線照射可導致細胞DNA雙鏈斷裂、細胞周期阻滯于G2期，并啟動一系列DNA損傷修復機制防止在M期進行異常分裂，以對抗放射線損傷[12－13]。本研究中，流式細胞術提示單純放射線照射能顯著增加2株細胞的G2期細胞比例(P＜0.05)，而Tet聯合放射線照射與單純放射線照射相比，G2期細胞比例明顯降低(P＜0.01);MTT法與克隆形成實驗結果提示Tet聯合放射線照射能顯著抑制細胞增殖、增加細胞對放射線的敏感性，放射增敏比分別為1.73和1.40(P ＜0.05)。因此，我們推測Tet去除放射線照射誘導的G2期細胞阻滯可能是其放射增敏的機制之一。由于細胞在G2期能完成DNA損傷修復，而Tet可能導致尚未進行DNA修復的細胞直接進入下一周期，表現為G2期細胞比例減少，損傷后的細胞在進入到下一周期后不能正常生長而死亡，從而達到放射增敏作用。

綜上所述，最大非細胞毒性劑量的Tet對人鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2具有放射增敏作用，其機制可能與去除放射線照射誘導的G2期細胞阻滯有關。

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