HBV對肝癌細胞系 HepG2和 HepG2.2.15中MMP-2及MMP-9的表達影響

馮 華，吳 丹，金曉明

(1.牡丹江醫學院病理生理學教研室，黑龍江 牡丹江157011;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院病理科，哈爾濱150040;3.哈爾濱醫科大學病理教研室，哈爾濱150081)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤，其發病率高，起病隱匿，臨床缺乏有效的預防、檢測及治療手段，治愈率低下，在世界范圍內，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC最重要的病因，HBV復制在肝炎、肝硬化、肝癌的發生和發展過程中，甚至肝癌的轉移和復發階段都可能起重要作用。最近許多研究表明，HBV基因型、病毒變異、HBV-DNA水平與HCC存在一定的關系，卻還沒有統一觀點，甚至出現相反的結論。HBV致HCC的確切機制目前還不清楚。該項實驗通過對人肝癌細胞系(HepG2，HepG2.2.15)中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9的表達情況的研究及對腫瘤細胞侵襲轉移的影響來探討HBV導致HCC的發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細胞購于中科院上海細胞庫。人肝癌 HepG2.2.15細胞由復旦大學上海醫學院醫學分子病毒學重點實驗室惠贈。細胞培養液DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)由 Hyclone公司提供。胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司(HepG2細胞)及Gibco公司(HepG 2.2.15細胞)提供。明膠酶譜法所需試劑由Sigma公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HepG2細胞和 HepG2.2.15細胞用含10%胎牛血清，100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液，其中HepG2.2.15培養液中加入250 mg/L的 G418;及 2 mmol/L谷氨酰胺，25 mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液和1 mmol/L丙酮酸鈉，細胞均于37℃，5%CO2孵箱中培養，培養液2～3 d更換一次，待細胞生長至80%左右時進行傳代。HepG2.2.15細胞的培養要求符合二級生物安全標準，所有培養廢液按照傳染源處理。

1.2.2 細胞生長曲線測定 將兩種細胞經胰酶消化后，細胞計數板計數，按照1×104細胞/孔接種于24孔板，次日起每天消化計數3個復孔，測定細胞數，取平均值，連續計數7 d。

1.2.3 明膠酶譜 細胞傳代，調整兩種細胞的細胞數。使之在1×106/瓶，培養1 d后吸去培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，分別加入無血清的DMEM 2 mL/瓶，48 h后吸取培養液離心(3000 r/min)10 min。取上清－80℃凍存備用。根據Kleiner等的方法加以改進酶譜法(SDS-PAGE enzymography):取無血清培養液4 μL與4×上樣緩沖液混勻，放置于37℃孵箱中孵育30 min。取混合后樣品20 μL上樣于含1 g/L明膠的10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中，80 V恒壓下電泳，當溴酚藍跑至分離膠與濃縮膠分離處時改為120 V恒壓直到溴酚藍跑至凝膠底部，取出凝膠放于搖床中，用含25 mL/L TritonX-100的洗脫液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，20 mmol/L ZnCl2)振蕩洗脫3 次，每次30 min，然后加入適量孵育液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，20 mmol/L ZnCl2)置于37 ℃恒溫箱中孵育24 h，用染色液(0.1%考馬斯亮藍R-250，30%甲醇，10%冰乙酸)染色2 h，再用脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10%，冰乙酸濃度分別為 10%、10%、5%)分別脫色 30 min、1 h、2 h，此刻即可呈現出MMPs位于藍色背景下的白色透明條帶。將電泳凝膠在灰階模式下掃描，應用Band leader 3.0軟件分析，設定參考值，讀取條帶面積和酶解條帶灰度，酶表達量=條帶面積×(平均灰度值－背景灰度值)。

1.3 統計學方法 用SPSS 15.0軟件所得的HepG2細胞和HepG2.2.15細胞的 MMP-2和 MMP-9的酶表達量進行統計處理，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長曲線 在第1天HepG2細胞和生長速度慢于HepG2.2.15細胞，在第2天以后，其生長速度則明顯快于 HepG2.2.15 細胞(F=11.290，P ＜0.05)(表1，圖 1)。

表1 HepG2和HepG2.2.15細胞生長速度(細胞數×5000)

圖1 細胞計數

2.2 明膠酶譜檢測兩種細胞中MMP-9和MMP-2的表達情況 MMP-9在HepG2細胞中的表達高于HepG2.2.15細胞(P ＜0.05)，MMP-2 在 HepG2 細胞和HepG2.2.15細胞中的比較，表達差異無統計學意義(P ＞0.05)(表2)。

表2 明膠酶譜檢測2種細胞中MMP-2和MMP-9的表達情況

3 討論

HCC是我國最常見的惡性腫瘤之一，浸潤和轉移是HCC重要的惡性生物學行為，是制約臨床治療效果的重要因素。轉移的過程雖然復雜，但其中細胞外基質的降解和細胞表面黏附分子的改變是最重要的原因［1］。MMPs家族即是在此過程中發揮重要作用的一類蛋白水解酶。其中，MMP-2、MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，其在腫瘤細胞的浸潤和轉移灶的形成以及腫瘤血管化的過程中均起重要作用［2-3］。

HBx是HBV病毒中一種多功能調節蛋白，能影響細胞基因的轉錄，激活細胞內信號轉導，促進病毒復制，加速蛋白降解，調控細胞周期，調節細胞增殖、凋亡和肝細胞發生癌變等。HBx基因如何導致細胞向惡性變發展成為近年來研究的熱點，但明確的報道十分罕見。一些研究指出，HBVx蛋白可調控p21WAF1/CIP1蛋白的表達，從而影響細胞正常的代謝活動。p21WAF1/CIP1蛋白具有抗宿主細胞變異和復制、增殖的功能，由此發揮其抑癌作用。p21WAF1/CIP1蛋白在細胞凋亡中有雙重表現。一方面，p21WAF1/CIP1蛋白可抑制凋亡:p21的N端通過與caspase-3前體結合，使其不能活化，喪失對蛋白激酶的活化作用，受損細胞免于Fas介導的細胞凋亡。另一方面，p21WAF1/CIP1蛋白通過對細胞周期的阻滯間接參與了細胞凋亡。

HBx是肝細胞發生癌變的重要基因，它通過與細胞因子或蛋白結合而發揮肝癌變作用，在慢性HBV感染的肝臟細胞中，HBx可通過調控p21WAF1/CIP1基因的表達，發揮它在HBV相關性HCC中的癌變作用。HBx在不同的細胞狀態既可上調該基因的表達量，延長細胞從G1期進展到S期，也可下調p21WAF1/CIP1基因的表達，使受損的異常細胞無控制地增殖，導致HCC的發生。

該項實驗研究所用的細胞系HepG2.2.15細胞來源于HepG2細胞，其中轉染了HBV并能穩定復制。白文林等［4］的研究結果表明，HepG2.2.15 細胞所表達的p53的量較HepG2細胞所表達量為高。HBV在HepG2.2.15細胞中的復制對p53的表達及功能并沒有產生抑制作用，反而具有一定的促進作用。HBV作為一種病毒，它在細胞內的復制有可能作為激發p53活性的因素，使p53的表達及功能增強，進而可能導致細胞某些生物學活性(如細胞凋亡、細胞周期等)的改變，可能是細胞感染HBV后的保護性反應。這與本研究結果也具有相似性，即HBV促進了肝癌細胞的凋亡，使HepG2.2.15細胞的生長速度慢于HepG2細胞。

Saito等［5］發現大多數 MMPs是腫瘤細胞分泌的，但更多情況下是由宿主細胞，如巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞等分泌，因此MMPs表達被認為是一種誘導的宿主反應。這提示腫瘤細胞可以通過可溶性介質或膜結合分子與間質細胞進行信息交換，有利于腫瘤發生侵襲和轉移。

本研究中明膠酶譜結果顯示，HepG2細胞中的MMP-9的表達水平高于 HepG2.2.15細胞。提示HBV中的HBx可能通過調控p21WAF1/CIP1基因的表達，上調該基因的活性，繼而使p53的表達增強，從而促進細胞凋亡的發生，使 HepG2.2.15細胞分泌MMPs的量減少，從而影響了其侵襲和轉移的能力。對于同一細胞中MMP-2和MMP-9表達水平的差異，其可能的機制為:①兩者的調節機制不同，MMP-9的轉錄是由細胞因子(白細胞介素1、腫瘤壞死因子α等和表皮生長因子、血小板源性生長因子等)調控的，而MMP-2則由轉化生長因子β調控。②兩者在基膜和細胞外基質破壞的方式及程度，以及促進腫瘤浸潤與轉移中所起的作用不同。其詳盡機制目前仍未明了，推測可能與細胞的特異性有關。

綜上所述，HBV可通過多種途徑抑制HCC的生長，通過明膠酶分泌量的減少而影響其侵襲和轉移的能力。隨著對HBV相關機制的深入研究，對HCC與HBV相互關系的研究具有一定的指導意義。MMP-2和MMP-9的高表達可促進HCC的侵襲和轉移。該項研究對于特異性明膠酶抑制劑的研究及臨床應用也具有一定的指導意義。

［1］劉亮明，羅文，劉晶美，等.HBX在原發性肝癌發病中的作用及其生物治療策略［J］.世界華人消化雜志，2005，13(4):432-439.

［2］Chamber AF，Matrisian LM.Changing views of matrix metalloproteinase in metastasis［J］.Natl Cancer Inst，1997，89(6):1260-1265.

［3］Parsons SL，Watson SA，Collins HM，et al.Gelatinase(MMP-2 and MMP-9)expression in gastrointestinal malignancy［J］.Br J Cancer，1998，78(11):1495-1502.

［4］白文林，曲建，慧樓敏，等.HepG2與 HepG2.2.15細胞中p53表達及活性的比較［J］.實用肝臟病雜志，2008，11(5):295-311.

［5］Saito K，Takeha S，Shiba K，et al.Clinicopathologic significance of urokinase receptor and MMPS-9 positive stromal cells in human colorectal cancer:functional multiplicity of matrix degradation on hematogenous matastasis［J］.Int J Cancer，2000，86(1):24-29.