線粒體DNA變異與老年2型糖尿病患者易感性的相關性

湯冬玲 李 棟 文重遠 (武漢大學人民醫院，湖北 武漢 430060)

2型糖尿病(T2DM)是一種多基因遺傳異質性疾病。長期以來，有關其易感基因的識別和定位一直是人類基因研究的主要任務。糖尿病的分子遺傳學研究表明，僅少數病例與部分轉錄因子、胰島素基因、胰島素受體基因、胰島素受體底物1基因以及脂肪酸結合蛋白2基因等突變有關〔1，2〕。1992年，van den Ouweland等〔3〕報道了首例線粒體 tRNALeu(UUR)基因3243(A→G)突變致糖尿病的家系，為其分子遺傳學的研究開辟了新的領域。人類線粒體DNA(mtDNA)是母系遺傳的含有16569 bp的雙鏈環狀分子，由于缺乏組蛋白的保護和有效的DNA修復機制，具有很高的突變率，已成為諸多疾病的研究熱點〔4～6〕。本研究擬采用病例對照、PCR－RFLP、基因測序等方法對175例T2DM患者和200例糖耐量正常的健康人群mtDNA的ND1和ND2區的基因突變情況進行篩查;旨在探討該區內常見的基因變異與湖北地區T2DM的關系，為揭示糖尿病的發病機制提供新的線索。

1 對象與方法

1.1 對象 按1999年WHO T2DM診斷標準收集老年T2DM患者175例(男118例，女57例)，年齡(59.41±15.24)歲。對照組為同期健康體檢者200例(男130例，女70例)，年齡(60.83±16.01)歲。兩組年齡、性別、體重指數(BMI)均匹配(P＞0.05)。排除糖、脂代謝和內分泌紊亂的相關疾病，臨床和實驗室檢查結果未見異常。所選對象均來自湖北地區漢族人群，且無血緣關系。

1.2 生化指標的檢測 常規檢測空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇 (TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)，均在AU－2700型全自動生化分析儀上進行。餐后2 h血糖(2 h PG，氧化酶法)為患者口服葡萄糖粉75 g后2 h測定。血漿胰島素(FINS)濃度采用化學發光法檢測，胰島素抵抗采用李光偉等〔7〕推薦方法計算，即胰島素抵抗指數(HOMA－IR)=FBS×FINS/22.5。檢測質控均符合英國RIQAS國際質控標準。

1.3 基因型分析 提取模板DNA，血痕和毛球標本用Chelex－100方法，新鮮外周血標本用NaI法。采用PCR－RFLP結合測序技術，參照劍橋序列(GenBank J01415)，用Primer 5.0自行設計引物。有關引物序列、擴增片段長度、限制性內切酶見表1。25 μl反應體系中含 10 × Buffer 2.5 μl，200 μmol/L dNTPs，引物各10 pmol，1 U TaqDNA聚合酶，用雙蒸水補足體積。擴增產物經1%的瓊脂糖電泳鑒定后酶切，20 μl反應體系包括:PCR 產物10 μl，10 × Buffer(含 BSA)2 μl，限制性內切酶1 U，加滅菌去離子水補足體積。37℃過夜，65℃滅活。酶切產物用12%聚丙烯酰胺凝膠，200 V恒壓下電泳，EB染顯色。經VL凝膠成像系統觀察結果。以上引物由上海生工合成，限制性內切酶購自MBI公司。

1.4 統計學分析 對各組測定值進行正態性檢驗、方差齊性檢驗，不符合正態分布的取其自然對數。以±s表示呈正態分布資料。使用SPSS11.5軟件，采用Fisher精確概率法、t檢驗、χ2檢驗，多因素分析采用非條件Logistic回歸。

表1 PCR及RFLP反應條件

2 結果

2.1 臨床資料分析 兩組間年齡、年齡構成比和性別構成比差異均無顯著性(P＞0.05)。T2DM組體重指數(BMI)、FPG、2 h PG、HbA1c及TC均明顯高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，C 肽明顯低于對照組(P ＜0.05)，兩組間 TG、HDL－C、LDL－C 無顯著差異(P＞0.05)。見表2。

2.2 RFLP分析及測序 HaeⅢ切割位點為GG↓CC，野生型切割為180、157、147、97、15 bp 5 個片段;3394(T→C)可切割為180、157、147、76、21、15 bp 6 個片段;3316(G→A)切割為 254、180、147、15 bp 4 個片段(圖1)。Mnl切割位點為 CCTC，野生型切割為216、102、39和35 bp(圖1);NlaⅢ切割位點為酶切結果，正常野生型在4164處無酶切位點，電泳后只有318 bp一條電泳帶;若4164 A→G突變，酶切后產生118和200 bp兩個片段;若有4216 T→C突變，酶切后產生173和145 bp兩個片段。本研究在T2DM組檢測到7例4164突變、3例4216突變，對照組檢出5例4164突變，未檢出4216突變。AluI切割位點為AG↓CT野生型無酶切位點，電泳后只有466 bp一條帶;5178(A→C)則產生新的酶切位點，電泳后產生156與310 bp兩條帶。見圖1。

2.3 老年T2DM組與對照組mtDNA變異頻率比較 見表3。

表2 T2DM組與對照組一般臨床資料比較(±s)

表2 T2DM組與對照組一般臨床資料比較(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別BMI(kg/m2)FPG(mmol/L)2 h PG(mmol/L)HbA1c(%)C肽(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL－C(mmol/L)LDL－C(mmol/L)0.58 T2DM組 24.30±3.241)9.87±0.782)14.20±1.012)10.51±0.892)0.42±0.182) 5.12±1.242)對照組 23.67±2.56 4.35±0.53 5.84±0.65 4.78±0.47 0.51±0.25 4.68±1.05 1.54±0.58 1.41±0.25 2.43±1.64±0.78 1.37±0.17 2.55±0.64

圖1 PCR擴增產物酶切PAGE電泳圖譜

表3 T2DM組與對照組變異頻率比較〔n(%)〕

2.4 老年T2DM組不同mtDNA 5178A/C多態性患者血脂水平的比較 T2DM組5178A基因型血清TC水平低于5178C基因型(P ＜0.05)，但 TG、LDL－C、HDL－C、apoA、apoB、Lp(a)水平兩組無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

表4 T2DM組不同mtDNA 5178A/C多態性患者血脂水平比較(±s)

表4 T2DM組不同mtDNA 5178A/C多態性患者血脂水平比較(±s)

指標 5178A(n=61) 5178C(n=114) P值4.21±0.90 4.68±0.73 ＜0.05 TG(mmol/L) 1.48±0.67 1.54±0.83 ＞0.05 HDL－C(mmol/L) 1.08 ±0.48 O.89 ±0.26 ＞0.05 LDL－C(mmol/L) 2.48 ±0.59 2.52 ±0.49 ＞0.05 apoA(g/L) 1.21±0.28 1.19±0.29 ＞0.05 apoB(g/L) 0.85±0.22 0.86±0.25 ＞0.05 Lp(a)(mg/dl)TC(mmol/L)13.58±8.28 14.36±11.23 ＞0.05

3 討論

T2DM是一組多因素導致的代謝紊亂綜合征，患病率逐年上升。既往的糖尿病遺傳學研究主要集中在核DNA上。最近的分子遺傳學研究表明，線粒體基因異常參與了糖尿病的發生。它可導致呼吸鏈的酶活性下降，ATP合成減少，從而影響胰島β細胞分泌胰島素，最終直接或間接引發糖尿病。

mtDNA為雙鏈閉環形結構，長16.5kb，由一條重鏈和一條輕鏈組成，均有編碼功能。編碼區占全長的90%以上，共編碼2個rRNA(12S和16S)、22個調節線粒體蛋白質裝配的tRNA和13種編碼呼吸鏈復合體及ATP合成酶的蛋白多肽。mtDNA比核DNA重復性小，信息密度高，除與DNA復制和轉錄有關的一小段區域外，相鄰基因排列緊密，幾乎不含內含子。因此mtDNA任何區域的突變都有可能導致異常多肽的合成，使線粒體的氧化磷酸化功能下降。當線粒體提供的能量低于細胞行使正常功能所需的最低限度(即能量閾值)時，就會引起器官或組織的功能異常，導致相應的疾病。

3316及3394位于線粒體呼吸鏈的復合體Ⅰ區的ND1基因上，其中3316 G→A突變可使ND1亞單位上高度保守的疏水性亮氨酸錯義成親水性蘇氨酸，而3394 T→C點突變可使一個中性酪氨酸被親水性組氨酸取代，從而改變了 ND1亞單位的空間構型，影響NADH的活性，導致ATP的合成減少。本研究發現兩組間3394T→C突變率有差異，這與國內外報道基本一致〔8，9〕。結合臨床資料發現，突變陽性患者多在60歲后老年發病，BMI大于25 kg/m2，癥狀輕，無需胰島素治療，口服降糖藥，甚至飲食控制就可穩定病情。不同于經典線粒體糖尿病的臨床表型。認為該突變僅屬于輕度有害性突變，不是獨立的糖尿病致病因素，含有該位點突變者在其他高危因素的協同作用下，誘發糖尿病〔10〕。

4216突變可使NADH脫氫酶中一個中性酪氨酸被親水性組氨酸取代，使ND1蛋白的空間結構發生了改變，從而影響呼吸鏈復合體Ⅰ酶活性，導致線粒體氧化磷酸化功能受損，降低胰島β細胞分泌胰島素的能力，促進了糖尿病的發生。

ND2基因中5178C→A置換導致線粒體ND2基因亮氨酸被蛋氨酸取代，該位點在老年人群中具有較高的多態性，本研究顯示，5178A基因型在老年T2DM組和對照組中的頻率分別為34.9%和32.3%，兩組之間無顯著性差異，低于日本人群(45%)〔11〕，而高于我國云南地區(16.84%)，表明線粒體基因多態性存在種族和地區差異性。

糖尿病患者患動脈粥樣硬化性疾病的發病率較非糖尿病人要高，被認為是與糖尿病患者脂代謝紊亂及氧化應激增強有關。由于線粒體的三羧酸循環和呼吸鏈是利用乙酰輔酶A的主要途徑，而乙酰輔酶A是膽固醇合成的一個來源，線粒體的基因變異可能會影響膽固醇的代謝。本實驗中mtDNA 5178A基因型較5178C基因型血清TC顯著要低，說明該多態性在血脂代謝中有一定的作用。日本學者研究也發現5178A基因型在長壽人群中有較高的比例，并且在2型糖尿病人中有抗動脈粥樣硬化的作用，其作用機制有待進一步研究。

MTTL13243(A→G)是目前研究的突變熱點，本實驗未檢出該突變，可能與樣本量有限及地域、人種有關。有待于以后擴大樣本量加以驗證。研究中采用全血血細胞或毛球標本進行DNA分析，取材方便且易于保存，免去以往超速離心法純化線粒體的繁雜步驟，可推薦用于臨床遺傳性疾病的基因診斷。同時本研究將生物信息學相關軟件用于RNA二級結構的預測分析，完善了實驗方案。

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