牡丹江地區朝鮮族高血壓人群中BKβ2R多態性分析

宋 潔 孫 凱 張書捷 魯 雙 李翠萍 韓彥龍 卜曉波

(牡丹江醫學院生物教研室，黑龍江 牡丹江 157000)

中國各地區高血壓患病率總體上是北高南低，由東北向西南遞減，且原發性高血壓在不同民族中的發病率不同，提示遺傳背景與高血壓患病存在著一定的聯系〔1〕。緩激肽(BK)是重要的血管活性物質之一，通過緩激肽β2受體(bradykinin receptorβ2，BKβ2R)介導發揮作用。朝鮮族人群高血壓的發病率居全國56個民族前列，中國牡丹江地區為心血管疾病高發區并為朝鮮族人群聚居區。本研究以BKβ2R為候選基因，探討其多態位點與朝鮮族原發性高血壓的關系。

1 對象與方法

1.1 樣本采集 高血壓組取自2008～2011年于牡丹江市朝鮮民族醫院內科就診的原發性高血壓患者，均為世居牡丹江的朝鮮族人群，三代血親內無其他民族。符合1999年《WHO/ISH1999高血壓指南》制定的高血壓診斷標準〔2〕，且排除糖尿病、冠狀動脈硬化性心臟病、腎衰竭和繼發性高血壓者。共納入313例患者，年齡 (58.7±9.2)歲，血壓145.9/100.7 mmHg。

正常對照組取自2008年于牡丹江市朝鮮民族醫院門診體檢的健康人，無高血壓病家族史，體格檢查及常規化驗未見異常，共納入202名，年齡 (56，4±10.2)歲，血壓115.3/77.1 mmHg。各組受試者均無血緣關系，均了解實驗目的和內容，并自愿參加實驗。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取 取凍存乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝靜脈血全血300 μl，用杭州博訊公司的DNA提取試劑盒提取基因組DNA，－20℃保存備用。參照Braun等〔3〕設計，委托上海生工生物工程公司合成引物，上游:5′－GCAGAGCTCAGCTGGAGGCG－3′， 下 游:5′－CCTCCTCGGAGCCCAGAAG－3′。PCR 反應體系為 25 μl，其中模板 DNA 50 ng(1 μl)，引物各10 pmol/L(各 1 μl)，2 × TaqMiX 12.5 μl:MgCl2終濃度為2 mmol/L、Taq酶0.6 U、dNTP為0.2 mmol/L，雙蒸水9.5 μl，反應混合物混勻后瞬間離心，94℃預變性5 min，繼之32個循環，每個周期94℃變性60 s，60.5℃退火45 s，72℃延伸60 s，末次循環后72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。

1.2.2 單鏈構向多態性(single strain conformation polymorphism，SSCP) 取10 μl PCR產物加入5倍體積的變性液，煮沸變性10 min后立即冰浴。上樣于20%非變性聚丙烯酰胺凝膠(電泳緩沖液為2×TBE)，進行室溫，恒功率3 W 電泳20～24 h，電泳結束后，凝膠進行硝酸銀染色并拍照分析。

1.2.3 PCR產物測序分析 對SSCP中檢測到的不同帶形的樣本進行PCR擴增，對PCR產物克隆，菌液送北京恒博和泰生物科技公司進行測序，確定為胸腺嘧啶(T)還是腺嘌呤(C)。

1.3 統計學方法 應用SSCP13.0統計軟件，計量資料以±s表示，經Hardy－Wenberg遺傳平衡定律檢驗各基因型和等位基因分布頻率已達遺傳平衡，基因型和等位基因頻率在各組間的比較采用χ2檢驗，一般項目比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 高血壓組與對照組一般資料比較 兩組年齡、性別差異均無顯著性意義(P＞0.05)。高血壓組的體質量指數及血壓均明顯大于正常對照組(P＜0.01)，在生化指標中，高血壓組的總膽固醇明顯高于正常組(P＜0.05)，而血糖和血脂含量在兩組間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 PCR－SSCP電泳及測序結果 高血壓患者和正常組的DNA標本經PCR擴增，得到產物為122 bp的片段。經SSCP分析，產生3種基因型CC型純合子、TT型純合子和CT型雜合子，PCR產物經克隆及測序證實存在T－C置換。見圖1，圖2。

2.3 牡丹江地區人群BKβ2R基因－58T/C基因型和等位基因的分布 在牡丹江地區，BKβ2R基因 －58T/C多態性 TT、CT、CC基因型分布在高血壓人群和正常人群間差異無顯著性意義(P＞0.05)。T，C等位基因頻率在高血壓人群和正常人群間差異也無顯著性意義(P＞0.05)。見表2。

表1 高血壓組與對照組臨床指標比較(±s)

表1 高血壓組與對照組臨床指標比較(±s)

313 202年齡 58.7±9.2 56.4±10.6男/女(n) 160/153 103/99體重指數(BMI，kg/m2) 26.4±4.27 22.8±3.79收縮壓(SBP，mmHg) 145.9 ± 16.94 115.3±10.2舒張壓(DBP，mmHg) 100.7± 11.3 77.1±9.58總膽固醇(mmol/L) 5.4±1.12 4.78±0.58甘油三酯(mmol/L) 2.25±1.34 2.19±1.06血糖(mmol/L)n 5.01±1.56 4.98±1.71指標 高血壓組 正常對照組

表2 BKβ2R基因－58T/C突變基因型及其等位基因頻率在牡丹江地區人群中的分布〔n(%)〕

圖1 BKβ2R基因啟動子區PCR產物瓊脂糖電泳結果

圖2 PCR擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果

3 討論

BK是迄今發現的體內最強的血管舒張物質之一，直接擴張血管，對抗血管緊張素、去甲腎上腺素的縮血管作用，促進內源性舒血管物質的產生，其生理作用主要是通過存在于絕大部分組織器官β2受體介導的。BKβ2R屬于G蛋白耦聯受體，相對分子質量41696 Da，基因位于染色體14q32.2，含有3個外顯子，編碼364位氨基酸。1995年 Braun等〔3〕對人類 BKβ2R基因多態性位點的研究證實3個外顯子和1個啟動子區存在4種多態性。1999年Madeddu等〔4〕在對人類轉BK受體基因鼠和BK受體基因敲除鼠大動脈內注射BK實驗中，發現轉基因鼠血壓明顯降低，而基因敲除鼠無明顯變化，提示 BK和BKβ2R在血壓表型中具有重要作用。

關于BKβ2R基因多態與原發性高血壓相關性研究報道主要集中在 BKβ2R基因啟動子區 －58位 T/C多態的研究。Mukae等〔5〕對日本，Gainer等〔6〕對非洲裔美國，王兵等〔7〕對中國漢族的高血壓和正常血壓人群基因多態性分析，發現在高血壓患者中啟動子區－58等位基因的差異明顯，高血壓患者組中CC基因型和C等位基因分布頻率明顯高于正常對照組。但是在朝鮮族人群研究還未見報道。朝鮮族人具有獨特的生活方式如高飲酒，高鹽飲食(腌菜、泡菜)等，為高血壓患病的高危環境因素，導致朝鮮族為我國56個少數民族中高血壓患病率最高的四個民族之一。因此在牡丹江地區開展朝鮮族人群原發性高血壓分子遺傳學研究具有重要意義。通過實驗數據發現中國牡丹江地區朝鮮族原發性高血壓患者CC、CT、TT;C、T基因型頻率及基因頻率與正常對照組差異無統計學意義，C、T等位與正常對照組有差異統計學意義，說明BKβ2R基因啟動子區－58位T/C多態性與中國牡丹江地區朝鮮族人原發性高血壓可能無關，這與對北愛爾蘭和法國人群的多中心病例對照(ECTIM)研究、中國新疆哈薩克族人群〔8，9〕和原發性高血壓患者的研究結果一致，而與日本、非洲裔美國人及中國漢族人群的研究結果不一致。

在本研究中C等位基因頻率在高血壓組為0.487，低于以往報道亞洲日本人群C基因頻率是0.575，非洲裔美國人C基因頻率分別是0.62，中國漢族人群等位基因C為0.58。但高于新疆哈薩克族人群0.47，反映了不同種族基因型頻率存在差異。Madeddu等的研究發現BKβ2R基因敲除鼠的鹽敏感性增加，德國科學家Braun等〔10〕發現－58T等位基因轉錄效率較－58C略高，提示啟動子區－58C等位基因型降低BKβ2R基因轉錄效率導致高血壓。BKβ2R基因啟動子區－58C/T多態性雖然在朝鮮族原發性高血壓人群和正常的朝鮮族人群的頻率無顯著差異，但是－58C等位基因的低頻率的數據顯示了朝鮮族群體的高血壓的高危遺傳因素。雖然本文選擇的研究對象為無異族通婚的牡丹江地區朝鮮族人群，并嚴格限定了入選標準，所選樣本具有群體代表性。但在朝鮮族高血壓人群中的作用需在不同地區加大樣本做大量的調查檢測。

綜上，BKβ2R基因啟動子區－58位T/C多態性與中國牡丹江地區朝鮮族人原發性高血壓無關，不是朝鮮族原發性高血壓的主要遺傳因素。可見，基因多態性與原發性高血壓相關性具有種族、民族特征，不同人群的原發性高血壓遺傳背景也不盡相同。

1 趙秀麗，陳 捷，崔艷麗，等.中國14省市高血壓現狀的流行病學研究〔J〕. 中華醫學雜志，2006;86(16):1148－52.

2 中國高血壓防治指南修訂委員會.中國高血壓防治指南(2005修訂版)〔M〕.北京:人民衛生出版社，2005:12－27.

3 Braun A，Kammerer S，Bohme E，et al.Identification of polymorphic sites of the human bradykinin β2receptor gene〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1995;211(1):234－40.

4 Madeddu P，Enanueli C，Gaspa L，et al.Role of the bradykinin β2recep－tor in the maturation of blood pressure phenotype:lesson from transgenic and knockout mice〔J〕.Immunopharmacology，1999;44(1－2):9－13.

5 Mukae S，Aoki S，Itoh S，et al.Promoter polymorphisim of the β2bradykinin receptor geng is associated with essential hypertension〔J〕.Jpn Circ J，1999;63(10):759－62.

6 Gainer JV，Brown NJ，Bachvarova M，et al.Altered frequency of a promoter polymorphism of the kinin β2 receptor gene in hypertensive African－A－mericans〔J〕.Am J Hypertens，2000;13(12):1268－73.

7 王 兵，劉國仗，黨愛民.緩激肽β2受體基因啟動子區點突變與高血壓病的關系〔J〕.中華心血管病雜志，2001;29(4):203－5.

8 Mulatero P，Williams TA，Milan A，et al.Blood pressure in patients with primary aldosteronism is influenced by bradykinin β2 receptor and alphaadducin gene polymorphisms〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2002;87(7):3337－43.

9 李南方，汪迎春，周 玲，等.緩激肽β2受體基因啟動子區－58T/C多態性與哈薩克族人原發性高血壓的相關性分析〔J〕.醫學分子生物學雜志，2008;5(2):110－3.

10 Braun A，Kammerer S，Maier E，et al.Polymorphisms in the gene for the human β2－bradykinin receptor.new tools in assessing a genetic risk for bradykinin－associated diseases〔J〕.Immunopharmacology，1996;33(1－3):32－5.