腎癌組織中MMP-2、MMP-9及VCAM-1的表達變化及意義

趙志紅 倪曉辰 仇 煒 張愛莉 (河北醫科大學附屬第四醫院泌尿外科，河北 石家莊 050011)

腎癌是我國常見的泌尿系統惡性腫瘤，其發病率近年有上升趨勢。基質金屬蛋白酶(MMPs)可通過降解細胞外基質(ECM)，促進惡性腫瘤的侵襲和轉移〔1〕。MMP-2和MMP-9是MMPs家族成員，能夠水解基底膜成分Ⅳ型膠原，促進腫瘤的浸潤與轉移。血管細胞黏附分子1(VCAM-1)參與多種細胞間的黏附，與腫瘤的浸潤轉移及免疫逃逸有密切關系。基于上述分子在惡性腫瘤進展中的重要作用，本研究通過檢測并比較MMP-2、MMP-9和VCAM-1在腎癌及癌旁腎組織的表達情況，為腎癌的治療和判斷預后提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 腎癌患者隨機取自我院于2009年4月至2010年2月在泌尿外科住院病人48例，其中男37人，女11人，年齡35～82歲，平均年齡(60.9±9.3)歲。所有患者術前均未進行治療，經腎腫瘤根治性切除術后病理證實為腎透明細胞癌。所有患者均于術后取癌及癌旁腎組織。之后快速切取少量置于10%甲醛溶液中固定，其余組織立即投入液氮中保存備用。

1.2 主要試劑 兔抗 MMP-9、VCAM-1多克隆抗體，小鼠MMP-2、β-actin單克隆抗體均購自Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒及DAB酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組織化學方法 采用免疫組化S-P法檢測，石蠟包埋后切成5 μm厚的切片，脫蠟復水，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，抗原熱修復，正常山羊血清封閉，依次滴加一抗、二抗、辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液孵育，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對照。光鏡下觀察，MMP-9、MMP-2及VCAM-1表現棕褐色或棕黃色陽性顆粒。半定量結果評定標準參考許良忠〔2〕等報道的方法，即染色強弱分數標準為:棕褐色3分;棕黃色2分;淡黃色1分;無著色0分。陽性細胞計數:一個視野內著色細胞＞75%為4分;51% ～75%為3分;11% ～50%為2分;≤10%計為1分;陰性為0分。兩項得分乘積，0～3分為陰性表達“－”;3分以上為陽性表達“+”。

1.4 明膠酶圖分析 稱取約30 mg液氮凍存標本裂解后蛋白定量，各組均取20 μg蛋白與5×上樣緩沖液 (0.1 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，20%甘油，0.1% 溴酚藍，4%SDS) 混勻，上樣于凝膠(含0.2%明膠)加樣孔內。4℃條件下恒壓(120 V)電泳2～3 h。電泳結束后，凝膠經2.5%Triton X-100漂洗三次，每次15 min，使明膠酶復性;棄去漂洗液，加入反應緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2)中，于37℃下溫育過夜，使明膠酶充分水解凝膠中的明膠。之后經考馬斯亮藍染色、脫色液脫色至出現白色清晰條帶。然后使用凝膠成像系統進行成像并進行灰度掃描。

1.5 Western印跡分析 取上述定量后蛋白裂解液20 μg與5×SDS上樣緩沖液(0.1 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，20% 甘油，0.1%溴酚藍，10% β-巰基乙醇，4%SDS)混勻，煮沸變性后經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。經轉膜、5%脫脂牛奶封閉、一抗及二抗孵育和化學發光等檢測β-actin的表達水平以作為上述明膠酶圖的內參照，使用凝膠成像分析系統掃描其灰度值。

2 結果

免疫組化結果顯示，腎癌組織結構排列紊亂，缺乏典型腎小管、腎小球等結構，MMP-2、MMP-9及VCAM-1陽性顆粒均呈典型的棕褐色顆粒，而癌旁組織則僅有散在的棕褐色顆粒 (圖1)。MMP-2，MMP-9及VCAM-1免疫組化結果表明MMP-2、MMP-9及 VCAM-1在腎癌組織中表達升高 (P＜0.01) (表1)。明膠酶圖結果顯示，腎癌組織中MMP-2及MMP-9的明膠酶活性較癌旁組織明顯升高 (P＜0.01)(圖2，表1)。因此上述結果提示，MMP-2、MMP-9及VCAM-1在腎癌組織中表達水平增強，這些分子可能在腎癌的發生發展過程中起到重要作用。

圖1 腎癌組織及癌旁組織中MMP-2、MMP-9及VCAM-1的表達變化(DAB，×100)

圖2 MMP-2及MMP-9在腎癌及癌旁組織的活性變化(明膠酶圖分析)

表1 MMP-2、MMP-9及VCAM-1在腎癌及癌旁組織中表達差異比較(n=48)

3 討論

腎癌的組織類型包括透明細胞癌、乳頭狀腺癌、嫌色細胞癌、未分化癌等，其中透明細胞癌最為多見。腫瘤的浸潤、侵襲及轉移能力是惡性程度的生物學基礎。在腫瘤的浸潤侵襲過程中涉及多種細胞外基質與細胞分泌成分的相互作用。MMP-2及MMP-9是兩種常見的ECM水解酶類，它們可以通過水解基底膜成分促進腫瘤細胞遷移與侵襲，因此它們是兩種遷移相關蛋白，與腫瘤細胞的侵襲性有關。以往研究表明，MMP-2及MMP-9在多種腫瘤組織中高表達〔2～5〕，但這些研究主要通過免疫組織化學或Western印跡的方法對MMPs的表達量進行檢測。本研究中采用靈敏度高、價格低廉的明膠酶圖法進行檢測，因此可以直接反映出腎癌組織中MMP-2及MMP-9的明膠酶活性。結果表明MMP-2及MMP-9活性的增高可能與腎癌的發病及惡性化密切相關。VCAM-1是一種細胞表面黏附分子，它是介導腫瘤免疫的重要分子〔6〕。本文結果顯示，VCAM-1在腎癌組織中表達陽性率明顯增加，因此推斷VCAM-1的高表達與腎癌也有密切聯系。

惡性腫瘤的個體化治療是今后治療手段改進的新趨勢。檢測每個病例腫瘤細胞特殊蛋白的表達譜對于評估疾病的特點及制定個體化治療策略具有重要意義。對于腎癌組織中高表達某些特征性蛋白的患者，則可以通過藥物或其他措施抑制這些特征性蛋白的表達以達到更好的治療效果。因此，方便高效的檢測手段是今后個體化治療方案制定的前提。對于高表達上述腫瘤相關蛋白的患者，在術后應用藥物干預這些蛋白的表達水平可能是降低腫瘤復發、延長患者生存率的有效手段。

1 Brassart B，Randoux A，Hornebeck W，et al.Regulation of matrix metalloproteinase-2(gelatinase A，MMP-2)，membrane-type matrix metalloproteinase-1(MT1-MMP) and tissue inhibitor of metalloproteinases-2(TIMP-2)expression by elastin-derived peptides in human HT-1080 fibrosarcoma cell line〔J〕.Clin Exp Metastasis，1998;16:489-500.

2 許良忠，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準〔J〕.中國癌癥雜志，1996;6:229-31.

3 Liu Z，Li L，Yang Z，et al.Increased expression of MMP-9 is correlated with poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma〔J〕.BMC Cancer，2010;10:270.

4 Gerstein ES，Sini L，Ryabov AB，et al.Comparative enzyme immunoassay of matrix metalloproteinases-2，-7，-9 and their tissue inhibitor-2 in tumors and plasma of patients with gastric cancer〔J〕.Bull Exp Biol Med，2009;148:899-902.

5 Alshenawy HA.Immunohistochemical expression of epidermal growth factor receptor，E-cadherin，and matrix metalloproteinase-9 in ovarian epithelial cancer and relation to patient deaths〔J〕.Ann Diagn Pathol，2010;14:387-95.

6 Wu TC.The role of vascular cell adhesion molecule-1 in tumor immune evasion〔J〕.Cancer Res，2007;67:6003-6.