腦缺血后大鼠腦實質DNA損傷修復相關基因Gadd45β蛋白的表達

李建瑞 李長清 劉迎梅 劉 彬 (重慶醫科大學附屬第二醫院神經內科，重慶 400010)

近年來有研究表明〔1〕，生長抑制與DNA損傷修復基因β(Gadd45β)缺失的大鼠在活動誘發的成熟海馬區神經祖細胞增殖和新生神經元的樹突增長中存在明顯缺陷。Gadd45β可能是參與調節神經元回路活化、DNA修飾與成年腦內神經再生外源性調節因子分泌的關鍵環節之一。但腦缺血性損傷后Gadd45β的表達變化及其作用不清楚，本研究通過檢測在缺血周邊區Gadd45β蛋白的表達變化，探討其在腦缺血后促損傷的神經元再生和神經修復方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及動物模型制作 健康SD大鼠94只，雄性，鼠齡3個月左右，體重250～280 g(由重慶醫科大學動物中心提供)，將94只大鼠隨機分成正常大鼠組4只、假手術組30只、腦I/R對照組30只和腹腔注射PDTC組(PDTC組)30只，除正常組外，各組又分別分成缺血再灌注后6、12、24、48及72 h組5個亞組，每個亞組6只。腦I/R組和PDTC(四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯)組各大鼠均采用Zea等〔2〕的線栓法，建立大鼠左側大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，缺血2 h后再灌注，腦I/R對照組各大鼠在再灌注后0.5 h腹腔注射生理鹽水(100 mg/kg)，PDTC組各大鼠缺血再灌注后0.5 h腹腔注射PDTC(100 mg/kg)。以清醒后出現對側上肢為重的癱瘓及同側Homer征為模型成功的判斷標準。假手術組除插線1 cm同時腹腔注射同等劑量的生理鹽水外，其余步驟同PDTC組。正常大鼠不經任何處理直接取材檢測。

1.2 運動功能評分 參照 Zea Longa〔2〕的5分法進行評分。術后大鼠清醒時(多為術后1.5～3 h)進行第一次評分，術后24 h、72 h 再次評分。

1.3 標本采集及細胞學檢查 試驗組動物在規定時間點取材，40 g/L多聚甲醛(4℃)經心臟灌注固定，立即取腦自視交叉平面向后冠狀切開制成5 mm厚的組織塊，用4%多聚甲醛固定24 h后，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，切片厚4 mm，HE染色，光鏡高倍鏡(400倍)下，隨機觀察缺血周圍6個不重疊的視野，每個視野不少于100個細胞，取其平均數。

1.4 Gadd45β蛋白的檢測 采用免疫組化(SABC)法，Gadd45β為兔多克隆抗體(Santa Cruz公司提供)稀釋度為1∶50。按照試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。取缺血后再灌注各組大腦切片如0.01 mol/L PBS代替一抗孵育時，Gadd45β蛋白質免疫反應陰性，表明一抗的特異性較強。

1.5 半定量分析Gadd45β蛋白 采用Western印跡法，在相應時相點處死大鼠，按照凱基全蛋白提取說明書提取全蛋白，應用Bradford法測定提取物的蛋白濃度，用12%分離膠行蛋白SDS－PAGE變性電泳，分離含一定量蛋白的全蛋白抽提物，檢測Gadd45β和β－actin時每泳道蛋白加樣量均為40 μg。電泳結束，將蛋白電轉印至 PVDF膜;TBS洗膜后，用一抗工作液孵膜，4℃過夜 (16～18 h);TBST緩沖液洗膜3次，用HRP標記二抗工作液孵膜，37℃1 h;洗膜3次，ECL化學發光法顯影、拍照，實驗重復5次，圖像處理系統對條帶進行灰度值測定。以β－actin為 內 參 照，一 抗 為 小 鼠 抗 β－actin單 克 隆 抗 體(1∶1000)，二抗為 HRP標記羊抗小鼠 IgG(1∶1000)。Western印跡膜片用Chemi Doc－XRS系統掃描，并用 QuantityOne 4.6版圖像分析軟件(Bio－Rad公司產品)測量Gadd45β蛋白和內參照β－actin蛋白各顯色條帶的平均光密度值，以Gadd45β與對應的內參照 β－actin蛋白顯色條帶的 OD值的比值標示Gadd45β蛋白相對表達量。

1.6 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠運動功能評分 腦I/R組和PDTC組大鼠在術后清醒時評分相近，兩組大鼠在造模術后各時間點神經功能缺損評分變化趨勢相同，腹腔注射PDTC后大鼠在術后24 h，72 h的評分較腦I/R組高，但第72小時評分有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點神經功能評分( ± s，n=6)

表1 各組大鼠不同時間點神經功能評分( ± s，n=6)

與腦I/R對照組比較:1)P＜0.05

72 h假手術組組別 再灌注后清醒 再灌注后24 h 再灌注后0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00腦I/R組 2.83±0.41 2.42±0.49 1.83±0.26 PDTC組 2.82±0.40 2.67±0.41 2.33±0.521)

2.2 各組大鼠腦組織Gadd45β的表達 正常大鼠可見少許Gadd45β蛋白表達，位于神經元細胞核，被染成棕黃色，主要見于海馬。假手術組大鼠腦組織中Gadd45β蛋白免疫反應陽性細胞與正常大鼠比較無明顯差別。在腦I/R組大鼠Gadd45β蛋白的免疫陽性反應見于細胞核，主要在缺血區皮質缺血半暗帶表達，而缺血中心區則很少。與假手術組相比，不同時間點MCAO大鼠缺血對側Gadd45β蛋白的表達無顯著增加，在再灌注后6 h缺血側Gadd45β蛋白陽性細胞數開始增多，12 h進一步增多，24 h達到高峰，之后開始下降，48 h，72 h進一步下降但仍高于假手術組主要見于缺血側皮層的頂葉區，在丘腦也有表達。PDTC組在各時間點陽性細胞數均顯著少于腦I/R組，高于假手術組，但Gadd45β蛋白表達與腦I/R組呈現相同變化趨勢。見圖1，表2。

2.3 半定量檢測各組大鼠腦組織Gadd45β蛋白表達 腦I/R組Gadd45β蛋白在缺血再灌注后6 h開始升高，12 h進一步增多，24 h達到高峰，48 h有所下降，72 h進一步下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。PDTC組在各時間點Gadd45β蛋白表達與腦I/R組呈現相同趨勢但明顯低于腦I/R組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖2，表3。

圖1 各組大鼠Gadd45β表達(×400)

表2 各個時間點Gadd45β蛋白的表達情況(細胞數/視野， ± s，n=6)

表2 各個時間點Gadd45β蛋白的表達情況(細胞數/視野， ± s，n=6)

與腦I/R組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01，下表同

72 h腦I/R組 7.50±1.87 13.16±2.14 27.0±2.82 15.83±1.72 1組別 再灌注后6 h 再灌注后12 h 再灌注后24 h 再灌注后48 h 再灌注后0.17±1.72 PDTC組 4.66±1.212) 8.67±1.752) 15.83±2.042) 10.66±1.632) 6.67±1.631)假手術組 2.16±0.752) 2.33±1.212) 2.50±1.042) 2.33±1.032) 2.16±1.172)

表3 各組大鼠各個時間點Gadd45β蛋白的表達(n=6，±s)

表3 各組大鼠各個時間點Gadd45β蛋白的表達(n=6，±s)

72 h腦I/R對照組 0.93±0.017 0.99±0.015 1.10±0.055 0.90±0.033組別 再灌注后6 h 再灌注后12 h 再灌注后24 h 再灌注后48 h 再灌注后0.84±0.017 PDTC組 0.85±0.0212) 0.87±0.0122) 0.91±0.0222) 0.83±0.0101) 0.80±0.0202)

圖2 Western印跡檢測各時間點Gadd45β蛋白表達

3 討論

最新研究表明，在缺血后的神經元中，可以引起DNA單鏈及雙鏈損傷或斷裂，進而導致神經元損傷和死亡〔3，4〕。大量的研究已發現損傷的DNA可以引起Gadd45的表達增多。作為DNA損傷及誘導相關基因 Gadd45，由 Gadd45α、Gadd45β 和Gadd45γ 三種亞型組成〔5〕。

近年來已有研究表明腦缺血后Gadd45的表達在促進受損的腦組織修復和抗損傷方面發揮著重要作用。研究發現出生后7日的新生小鼠腦缺血后受損腦組織的中有Gadd45蛋白的大量表達，推測Gadd45在對抗過氧化物引起的腦組織損傷和促進神經元修復中發揮重要作用〔6〕。Jin等〔7〕發現，局限性腦缺血4h后的大鼠，在其缺血的皮層開始出現Gadd45 mRNA的表達，而在缺血24 h后則主要表達在缺血半暗帶區域內。本文發現在腦缺血再灌注后6 h時Gadd45β蛋白開始增多，24 h達到高峰，之后開始下降，但72 h仍高于假手術組，提示腦缺血可誘導持續達72 h以上的Gadd45β蛋白表達增加。

我們在研究中發現，PDTC組的大鼠在腹腔注射四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯后，大鼠缺血腦組織Gadd45β蛋白表達增加受到明顯抑制，提示四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯可抑制腦缺血誘導的Gadd45β表達。四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯為NF－κB的抑制劑。Jin等〔8〕研究發現在外界壓力和細胞因子的刺激下NF－κB的亞單位RelA可以激活Gadd45β的表達。由以上研究提示腦缺血誘導的Gadd45β表達可能受到NF－κB信號通路活動的調控。

Bin等〔9〕研究認為Gadd45β對受到氧化應激和化學藥物的刺激發生損傷和變性的視網膜神經節細胞具有保護作用，有抑制視網膜神經節細胞變性的作用。Gadd45β不僅對大鼠受損神經節細胞具有保護作用而且可能對中樞神經系統中其他受損神經元也有保護作用。腦缺血誘導的Gadd45β表達主要在缺血區皮質缺血半暗帶，而缺血中心區則很少。已有大量研究表明腦缺血后存在氧化應激，Ca內流等引起的神經元的損傷。由此提示Gadd45β對腦缺血后氧化應激損傷的神經元也有可能有神經保護和促進受損神經元修復的作用。我們通過對造模術后不同時點大鼠運動功能評分后發現，與腦I/R組比較PDTC組大鼠造模術后肢體活動恢復受到明顯的抑制，證明抑制了Gadd45β的表達不利于癱瘓肢體的恢復，進一步說明Gadd45β有神經康復作用。

近年來的研究發現大鼠腦缺血后可以引起BDNF和FGF－1等外源性神經生長因子的表達和分泌增加。已有大量研究表明在神經系統發育、成熟過程中維持神經元功能和神經元損傷后的再生修復和防止神經細胞退行性變等多方面BDNF和FGF－1發揮著重要作用。Alam等〔10〕研究發現FGF－1的啟動因子B是FGF－1基因表達的必要因子，其在調控FGF－1基因的轉錄和翻譯中發揮著重要的作用。有研究發現〔11〕BDNF調節區Ⅸ的啟動可促進更多的BDNF表達，抑制DNA甲基化酶的活動可使得BDNF調節區Ⅸ的DNA不發生甲基化從而對調節區Ⅸ的啟動有促進作用。說明BDNF調節區ⅨDNA脫甲基有促進BDNF表達作用。研究發現，電刺激可以誘導腦組織Gadd45β的表達，大鼠缺失Gadd45β基因后，在電刺激等活動誘發的成熟海馬區神經祖細胞增殖和新生神經元樹突生長中存在明顯缺陷，Gadd45β通過調節BDNF和FGF－1的脫甲基化促進BDNF等以旁分泌的形式分泌〔1〕。BDNF和 FGF－1分泌到腦組織中后就可以發揮其營養神經元和促進樹突生長的作用。以上這些研究發現提示，Gadd45β在調節神經修復和再生中，可能是最關鍵的環節之一，對其調控機制及其在神經修復中的作用進行系統深入研究有可能對腦卒中后的神經功能康復治療等方面帶來新思路。

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