保健灸法對更年期大鼠抗氧化能力及腦組織中p53蛋白表達的影響

王淑娟 王艷杰 石星業 宮 菲 趙 胤 (遼寧中醫藥大學針灸推拿學院，遼寧 沈陽 0032)

保健灸為無病而灸，未老先灸，是在具有保健功效的穴位上施灸，逐漸積累灸效，強身健體的一種方法，是中醫學“治未病”的重要內容。更年期是機體走向衰老的關鍵啟動期，在此階段機體內環境尤其是內分泌水平急劇變化，機體組織器官逐漸衰老，穩態失衡，抗氧化能力逐漸減弱，自由基顯著增多，自由基清除酶類活性下降〔1〕，出現多系統功能紊亂。本實驗采用與女性更年期相近似的雌性自然老化大鼠為研究對象〔2〕，觀察保健灸對自然更年期大鼠抗氧化能力及腦組織中p53蛋白的影響，以探討保健灸法的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SD雌性大鼠42只，由北京維通利華有限公司提供，許可證號:SCXK(京2006－0009)青年組14只，3月齡，體重190～250 g;12月齡28只，體重390～450 g，隨機分為保健灸組及對照組。各組動物在同等條件下常規喂養，實驗室光照充足，通風良好，溫度保持在(24±2)℃，濕度保持在40% ～60%。

1.2 實驗方法 保健灸組動物每周灸關元、足三里4次，持續2個月，青年組及對照組每周相同時間同樣抓取，但不灸，亦不讓其聞到灸的味道。持續2個月。

1.3 保健灸的部位和方法 大鼠關元、足三里穴定位，參照大鼠標準穴位圖譜。關元位于大鼠兩后肢根部連線的中點。足三里位于大鼠膝關節后外側，即脛骨粗隆下緣與腓骨小頭下緣連線之中點處。灸前將穴區直徑約1.0 cm左右的鼠毛剪干凈，用自制的大鼠固定器將大鼠固定，暴露穴區皮膚。自制艾炷:底盤直徑0.7 cm，艾柱直徑為0.1 cm，重1.0 g，放置于帶有小孔附雙面膠的橡皮墊上，將橡皮墊粘貼在穴區，小孔對準穴位，點燃艾炷。灸后局部皮膚略紅，無發泡。

1.4 主要儀器與試劑 TU1810PC紫外可見分光光度計(北京普析通用有限公司);RM2235型手動石蠟切片機，EG1150C型包埋機，HI1220型烘片機(德國LEICA)，BX51型OLYMPUS反射熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。p53一抗，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒(自武漢博士德生物工程有限公司)。

1.5 各組大鼠血清抗氧化相關指標檢測 實驗進行2個月后，各組動物禁食不禁水24 h后，每組隨機抽取8只大鼠，10%水合氯醛(3.5 ml/kg體重)腹腔麻醉下，經腹主動脈采血，靜置30 min后離心吸取上清，用于測定MDA及SOD。MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測定，SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法測定〔3〕，具體操作步驟按照生化試劑盒的說明書進行。根據公式分別計算MDA含量和SOD活性。

1.6 免疫組化法檢測各組大鼠腦組織p53的表達 剩余大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，開胸暴露心臟，先以生理鹽水200 ml灌至無血色后，更換4%多聚甲醛200 ml進行灌注。開顱取全腦，固定6 h以上，去除大腦額葉前6 mm和后1/2，脫水，用石蠟包埋，制作石蠟切片。p53蛋白的免疫組化染色切片中細胞核呈棕黃色的為陽性細胞。陰性對照片(PBS代替一抗)無棕黃色著色。檢測大鼠腦組織p53的表達水平。依照試劑盒說明書進行操作。灰度值測定:切片染色后，選擇染色良好區域，應用Leica Q550CW圖像采集和分析系統，每只大鼠觀察3張切片，每張切片在顯微鏡下(400倍)選取5個互不重疊視野，測定單位面積陽性細胞表達的灰度平均值作為其表達情況，取平均數以表示各切片蛋白的表達結果。此系統將白色灰度值設定為255，將黑色灰度值設定為0，故灰度值越高，表達越弱。

1.7 統計學方法 采用SPSS15.0軟件包進行統計分析。計量資料以±s表示，組間均數比較用單因素方差分析。相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中MDA、SOD含量的比較 與青年組比較，更年期對照組大鼠血清中MDA含量明顯升高，SOD活性明顯下降(P＜0.01);與對照組比較，更年期保健灸組大鼠MDA含量低(P＜0.05)，SOD活性升高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清中MDA、SOD含量變化( ± s，nmol/mgprot，n=8)

表1 各組大鼠血清中MDA、SOD含量變化( ± s，nmol/mgprot，n=8)

與青年組比較:1)P＜0.01;與對照組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

8.82±1.85 156.96±2.96更年期保健灸組 14.24±2.851)2) 111.21±2.201)3)更年期對照組 21.96±2.881) 95.08±2.171)含量青年組組別 MDA含量 SOD

2.2 各組大鼠腦組織中p53蛋白表達的比較 青年組p53蛋白呈弱表達，僅見少數細胞p53蛋白表達陽性，著色較淺。與青年組相比，更年期大鼠腦組織有大量棕黃色顆粒，陽性表達細胞數顯著增多。保健灸組大鼠腦組織p53蛋白表達有所上調，視野中散在棕黃色顆粒，陽性表達細胞數增多。見圖1。計算機圖像分析表明，更年期大鼠的腦組織中p53蛋白表達水平明顯高于青年組小鼠(148.35±16.92)，表明隨著年齡的增長，高表達的p53誘導了細胞的凋亡，促使機體的衰老。更年期保健灸組與對照組相比，蛋白表達明顯明降低〔(132.78±13.53)、(110.66 ±15.335)，P ＜0.05〕。

圖1 各組大鼠腦組織中p53蛋白表達(DAB，×400)

3 討論

人體衰老是一個長期漸進的過程，是生命力由旺盛到衰退逐漸轉變的積累過程，更年期是婦女衰老進程中的啟動期，此時腎氣漸虧，天癸將竭，沖任脈虛，精力體力腦力開始呈現衰退趨勢，多種代謝失調，是引發慢性老年性疾病的重要時期。

保健灸為無病而灸，未老先灸。通過在具有保健功效作用的穴位上施灸，逐漸積累灸效，以達防病保健的目的。關元為任脈與足三陰經的交會穴，具有益腎生髓、溫經通絡、扶陽固本之效。《醫學入門》載:“關元主諸虛損”，《針灸穴名解》中稱此穴為“人身陰陽元氣交關之處，為養生家聚氣凝神之所”。該穴聯系命門真陽，為陰中之陽穴。艾灸關元可補攝下焦元氣，扶助機體元陰元陽，延年益壽。足三里具有溫補脾胃，益氣養血，扶正培元的功效。《外臺秘要》云“三里養后天之氣，灸三里可使元氣不衰”。中醫學認為“腎為先天之本”，“脾胃為后天之本”，灸關元、足三里可以達到補腎健脾、祛病延年的目的。

現代醫學認為更年期階段隨著卵巢功能的衰退、體內性激素水平紊亂，脂質過氧化作用增強，自由基清除酶超氧化物歧化酶活性下降，機體的抗氧化能力降低，影響中樞神經系統和心血管系統的功能，出現一系列下丘腦與自主神經之間平衡失調的癥狀，如潮熱、出汗、情緒憂郁、神經過敏、失眠、疲勞等〔4〕。在衰老過程中，自由基引起大量的細胞衰老、死亡，資料表明這些細胞的衰老、死亡多屬于自由基引發的細胞凋亡〔5〕。MDA是機體內脂質過氧化反應的重要代謝產物，對細胞具有嚴重的毒性作用，血清中MDA的含量可以反映機體內脂質過氧化程度，間接反映細胞損傷的程度。SOD是廣泛存在于生物體內的重要抗氧化酶，其活性與年齡密切相關，隨著增齡，體內的SOD活性逐漸降低，清除自由基的能力逐漸減弱，使自由基在體內堆積，進一步加快老化的進程〔6〕。

艾灸具有較強的抗自由基損傷和抗脂質過氧化損傷的作用〔7，8〕。本實驗結果說明更年期大鼠機體內酶防御系統活性下降，清除氧自由基的能力降低，自由基代謝出現紊亂。而保健灸組大鼠與對照組比較，血清中MDA含量顯著降低，SOD活性增高，表明保健灸可增強更年期大鼠清除自由基的能力，降低機體內脂質過氧化反應物，從而達到延緩衰老的目的。

p53是調控細胞凋亡的重要蛋白因子，參與DNA損傷修復、細胞周期調控、細胞凋亡等過程。p53可以直接激活線粒體凋亡途徑導致細胞凋亡。正常情況下p53蛋白以潛在形式存在并維持低水平，p53過度表達可引起細胞的衰老〔9，10〕。本實驗結果表明隨著月齡的增長，p53蛋白表達升高，高表達的p53誘導了細胞的凋亡，促使機體衰老。而保健灸組大鼠腦組織中p53蛋白表達水平明顯低于對照組，提示保健灸法對增齡導致的p53蛋白表達增高具有一定的拮抗作用，并且p53表達下調與抗氧化作用同步。研究表明自由基過量會刺激細胞凋亡〔11〕，為此可以推斷保健灸法是通過增強了機體清除自由基的能力，一定程度抑制細胞的凋亡，從而反饋性下調了p53蛋白表達。

1 江仙遠，陳友香，侯安繼.更年康片治療更年期綜合征的機制研究〔J〕.中藥藥理與臨床，2001;17(1):36.

2 張紹芬，謝 倩，哈靈俠，等.戊酸雌二醇對更年期大鼠脾細胞凋亡及卵巢功能的作用〔J〕.生殖醫學雜志，2006;15(6):388－91.

3 李儀奎，王欽茂.中藥藥理實驗方法學〔M〕.上海:上海科學技術出版社，1991:205－36.

4 方玉榮，王立金.圍絕經期婦女血清性激素水平與自由基、血脂含量的變化〔J〕.實用婦產科雜志，2004;20(3):151.

5 徐 敏.人體自由基與衰老的關系〔J〕.臨床和實驗醫學雜志，2006;5(3):289－91.

6 童坦君，張宗玉.醫學老年學〔M〕.北京:人民衛生出版社，1995:37－8.

7 項麗靜.灸足三里、關元穴對運動大鼠肝組織自由基代謝的影響〔J〕. 西安體育學院學報，2005;22(6):73－5.

8 李曉泓，宋曉琳，張露芬，等.逆灸關元穴對自然更年期大鼠子宮HSP70、HSP70 mRNA、SOD、NOS的影響〔J〕. 中華中醫藥雜志，2010;25(1):46－9.

9 許少峰，付 麗.p53研究的新進展〔J〕.中華病理學雜志，2004;33(6):559.

10 朱燕珍.電針治療血管性癡呆大鼠對海馬CA1區P53表達的影響〔J〕. 福建中醫藥，2007;38(2):45－6.

11 Yand E，Korsmeyer SJ.Molecular mechanism of apoptosis:adiscourse on the bcl－2 family and cell death〔J〕.Blood，1996;88(2):386.