葉酸、維生素B12對高同型半胱氨酸血癥大鼠ICAM-1及VCAM-1表達的影響

王 新 郭曉林 王玉玲 姜雅秋 (吉林大學第一醫院心血管中心，吉林 長春 300)

目前國內外大量研究表明，高同型半胱氨酸(Hhcy)是動脈粥樣硬化(AS)的一個獨立危險因子〔1，2〕，血管壁免疫炎癥反應可能是Hhcy致AS的機制之一〔3〕。細胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAM)是位于細胞膜表面的大分子跨膜糖蛋白，在炎癥反應過程中起重要的作用〔3〕。葉酸、維生素B12是Hhcy代謝的輔助因子，可降低體內同型半胱氨酸(Hcy)的水平;但是通過補充葉酸和維生素B12是否能防止AS的進展，目前國內尚未報道。本研究通過觀察葉酸、維生素B12對Hhcy大鼠主動脈壁細胞間黏附分子(ICAM-1)及血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)表達的影響，進一步探討Hhcy導致AS的機制及葉酸、維生素B12對AS的預防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 8周齡雄性SD大鼠，體重190～210 g，由沈陽醫學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SCXK(遼)2003-0016。飼料為繁育鼠全價固體顆粒飼料，沈陽市于洪區前民動物飼料廠提供。蛋氨酸(Sigma公司，C7352)。葉酸(片劑)，天津飛鷹制藥有限公司生產(20060408)。維生素B12(片劑)，山西云鵬制藥有限公司生產(20061107)。ICAM-1、VCAM-1、免疫組織化學染色用一抗、二抗，購于北京中山生物技術工程公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及標本采集 將24只雄性SD大鼠隨機分為三組，每組8只。空白對照組:喂食基礎飼料，每日灌胃給予生理鹽水5 ml/kg。HHcy模型組:喂食高蛋氨酸飼料(基礎飼料中加入1.7%蛋氨酸)+每日灌胃給予生理鹽水5 ml/kg。葉酸、B12干預組:喂食高蛋氨酸飼料 +每日灌胃給予葉酸3.5 mg/kg、維生素B127 μg/kg。干預藥物每日用量為成人常用量等效劑量的4～6倍。各組SD大鼠連續灌胃給藥8 w，分籠飼養，自由進食飲水，于8 w處死所有大鼠，取血10 ml、升主動脈近心段0.5 cm。

1.2.2 主動脈壁形態學觀察 將所取主動脈10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，將切片置于光鏡下觀察其形態學變化并拍照。

1.2.3 應用ELISA法檢測血漿Hcy水平。

1.2.4 應用鏈親素卵白素-過氧化物酶(SP)法檢測主動脈壁ICAM-1和VCAM-1的表達 取組織切片脫蠟水化，0.3%H2O2甲醇處理切片20 min，蒸餾水、磷酸鹽緩沖液(PBS)各洗5 min。用枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復15 min，取出迅速冷卻，PBS洗3次，1 min/次。滴加封閉液，37℃孵育20 min，傾去不洗。分別加入用PBS按1∶100稀釋的ICAM-1和VCAM-1一抗37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次2 min。加入二抗，37℃孵育20 min。PBS洗3次，每次2 min。加入SP復合物孵育20～30 min。PBS洗3次，每次2 min。二氨基聯苯胺(DAB)-H2O237℃孵育10 min。PBS洗，蒸餾水洗。Harris蘇木素染核10 min。蒸餾水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。光鏡下觀察，每片隨機選取3個視野進行陽性細胞百分數計數。設立陰性對照(以PBS代替一抗)。

1.3 統計學方法 應用SPSS15.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用成組單因素方差分析。

2 結果

2.1 主動脈壁形態學觀察 空白對照組血管壁結構清晰，內膜光滑完整，平滑肌細胞排列整齊，內皮細胞結構完整，內皮下未見脂質及炎性細胞浸潤，中層及外膜結構清楚，未見病理改變;Hhcy模型組可見血管壁彌漫性隆起，突向管腔面，形成明顯斑塊，內膜明顯增厚，內膜下大量排列不規則平滑肌細胞(SMC)增生，內有脂質沉積，形成大小不等、形態不規則的泡沫細胞，膠原纖維和彈性纖維增多，內膜中有大量巨噬細胞浸潤，中層結構紊亂，平滑肌增生、壞死，并有炎性細胞浸潤，彈力板處及細胞間隙可見大量脂質沉積;葉酸、維生素B12干預組與HHcy模型組比較，胸主動脈血管壁無明顯隆起，內膜下有少許炎性細胞浸潤，中層平滑肌無明顯增生，未見泡沫細胞。見圖1。

2.2 各組血漿Hcy水平比較 各組血漿Hcy水平具有差異，Hhcy模型組的血漿Hcy水平明顯高于空白對照組(P＜0.01)。Hhcy模型組血漿Hcy水平明顯高于葉酸、維生素B12干預組(P＜0.01)。見表1。

圖1 三組主動脈壁形態學觀察(HE，×100)

2.3 各組血管壁ICAM-1、VCAM-1表達 各組血管壁ICAM-1、VCAM-1表達水平具有差異，Hhcy模型組的血管壁 ICAM-1、VCAM-1表達明顯高于空白對照組(P＜0.01)。Hhcy模型組血管壁ICAM-1、VCAM-1表達明顯高于葉酸、維生素B12干預組(P＜0.01)，但是仍高于空白對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 血漿 Hcy、血管壁ICAM-1、VCAM-1在各組中的表達水平( ± s，n=8)

表1 血漿 Hcy、血管壁ICAM-1、VCAM-1在各組中的表達水平( ± s，n=8)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與Hhcy模型組比較:2)P＜0.01

組別 血漿Hcy(μmol/L)主動脈壁ICAM-1(%) VCAM-1(%)7.39±2.46 15.04±4.59 18.75±3.17 Hhcy模型組 115.04±10.971) 52.51 ±7.941) 55.86±11.561)葉酸、B12組 16.13±1.152) 23.35±4.692) 28.55±3.632)空白對照組

3 討論

ICAM-1和VCAM-1是近年研究較多的細胞膜表面大分子跨膜糖蛋白，是細胞之間及細胞與細胞外基質之間的一類黏附物質的總和，屬于免疫蛋白超家族的一員，可促進血液中游走的單核細胞向內皮細胞黏附，進入炎癥部位，導致AS形成〔4〕。Neville等發現長期接觸Hcy的上皮細胞ICAM-1、組織型纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的表達水平升高，且ICAM-1，PAI-1表達水平與內皮衰老程度呈正相關〔5〕。Koga等〔6〕同時發現人動脈內皮細胞在Hcy刺激下可增加表面黏附分子VCAM-1和E-選擇素的表達和mRNA水平。本研究表明，Hhcy模型組ICAM-1和VCAM-1表達水平較空白對照組明顯上調，進一步表明ICAM-1和VCAM-1參與了Hhcy所致AS形成過程。

Hcy又稱高半胱氨酸，是一種含硫氨基酸，為蛋氨酸脫甲基后的產物。維生素B12是Hcy代謝的輔酶，可使5-甲基四氫葉酸轉變為四氫葉酸，所供出的甲基由Hcy獲得在蛋氨酸合成酶作用下形成蛋氨酸。如維生素B12降低可使Hcy形成蛋氨酸受阻，造成Hcy水平升高。葉酸缺乏時，可導致Hcy再次甲基化生成蛋氨酸受阻，同時還影響亞甲基四氫葉酸還原酶的活性，進一步影響甲基四氫葉酸的生成，是影響Hcy水平的最主要因素〔7〕。黃延焱等〔8〕研究發現血清葉酸、維生素 B12濃度與血清Hcy水平呈負相關，增加葉酸、B族維生素的攝入可降低Hcy水平。本組觀察表明，葉酸、維生素B12干預組Hcy水平明顯低于Hhcy模型組，與國內外研究相符。同時根據光鏡下動脈壁形態學觀察可發現葉酸、B12干預組與Hhcy模型組比較主動脈血管壁無明顯隆起，內膜下有少許炎性細胞浸潤，中層平滑肌無明顯增生，未見泡沫細胞。說明補充葉酸和維生素B12可減輕Hhcy動脈粥樣硬化程度，對Hhcy致AS具有明顯預防作用。

1 Sadeghian S，Fallahi F，Salarifar M，et al.Homocysteine，vitamin B12and folate levels in premature coronary artery disease〔 J〕.BMC Cardiovasc Disord，2006;6:38.

2 Kaul S，Zadeh AA，Shah PK.Homocysteine hypothesis for atherothrombotic cardiovascular disease:not validated〔J〕.J Am Coll Cardiol，2006;48(5):914-23.

3 張星虎.炎性反應與動脈粥樣硬化〔J〕.中國卒中雜志，2008;3(6):408-12.

4 Galkina E，Ley K.Vascular adhesion molecules in atherosclerosis〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007;27(11):2292-301.

5 Xu D，Neville R，Finkel T.Homocysteine accelerates endothelial cell senescence〔J〕.FEBS Lett，2000;470(1):20-4.

6 Koga T，Claycombe K，Meydani M.Homocysteine increases monocyte and T-cell adhesion to human aortic endothelial cells〔J〕.Atherosclerosis，2002;161(2):365-74.

7 Skurk C，Walsh K.Death receptor induced apoptosis:a new mechanism of homocysteine-mediated endothelial cell cytotoxicity〔J〕.Hypertension，2004;43(6):1168-70.

8 黃延焱，盧曉哲，程梅芬.老年腦梗死患者血清同型半胱氨酸水平及藥物干預研究〔J〕.中國臨床康復，2003;7:1112-3.