吸煙對2型糖尿病大鼠腎臟中期因子表達的影響

王曉蕾 時藝珊 柏 松 (沈陽醫學院沈洲醫院內分泌科，遼寧 沈陽 110002)

2007年中國糖尿病患者人數已達3980萬，預計2025年將達到5930萬〔1〕。對糖尿病易患因素及其發病機制的研究已經引起學者們的極大關注。吸煙是導致人群多種疾病發生和死亡的重要影響因素。研究表明，吸煙與糖尿病(尤其2型糖尿病)及其并發癥的發病有明確關系〔2〕。本研究通過觀察吸煙的2型糖尿病大鼠腎臟組織中期因子(midkine，MK)的表達情況，分析吸煙對糖尿病腎病發病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 取60只Wistar大鼠(購自中國醫科大學)，8周齡，雄性，清潔級。體重130～200 g。去除體重差異較大的大鼠，隨機分配為三組。①正常對照組20只。②2型糖尿病非吸煙組20只。③2型糖尿病吸煙組20只。

1.1.2 主要設備及試劑 鏈脲佐菌素(streptoztocin，STZ，美國Sigma公司);顆粒飼料(購自中國醫科大學);高糖高脂飼料(自配);香煙為市售X牌香煙，尼古丁含量1 mg/支，焦油含量18 mg/支。RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及RT－PCR試劑盒(美國Ambion公司)。按GenBank合成引物。日立7170全自動生化儀(日本日立公司);PCR儀(德國Biometra公司);Chemi Imager 5500凝膠圖像系統(美國Alpha Innotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 ①確定胰島素抵抗動物模型:三組大鼠均每籠3～4只，飼養7 w，室溫21℃ ～26℃，濕度 50% ～60%，12 h光照周期，動物室內每天清掃消毒。正常對照組予普通飼料喂養，2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組給予高糖高脂飼料喂養。飲水為純凈水。三組7 w時測空腹血糖及胰島素，確定胰島素抵抗動物模型。②小劑量STZ靜脈注射誘導2型糖尿病模型〔3〕:2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組大鼠尾靜脈注射STZ 15 mg/kg(以pH4.5的0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液配成0.3%濃度)，對照組僅注射枸櫞酸鈉緩沖液。三組繼續原飼料喂養1 w后測空腹血糖及胰島素。確定2型糖尿病動物模型。③將2型糖尿病吸煙組大鼠20只關進自制“被動吸煙箱”內。吸煙箱上方有通風口與外界相通，側壁有與香煙直徑相通的孔，保證香煙煙霧由側壁孔可逐漸擴散至整個吸煙箱內。大鼠在此環境中“吸煙”，頻率設定為每天吸煙2次，每兩次間隔4 h，每次30 min。2型糖尿病非吸煙組及對照組大鼠同時也被關進其他“吸煙箱”相同時間，不輸入香煙煙霧。4 w后檢測三組空腹血糖、空腹胰島素及尿白蛋白水平。

1.2.2 空腹血糖、胰島素及尿白蛋白測定 第0周、第7周、第8周、第12周各測一次空腹血糖、空腹血清胰島素水平(禁食水12 h后尾靜脈采血)。計算胰島素抵抗指數。胰島素抵抗指數=空腹血糖(mmol/L)×空腹血清胰島素(mU/L)/22.5〔4〕。第0周、第7周、第8周、第12周各測一次尿白蛋白。

1.2.3 PCR法檢測MK的基因表達 實驗12 w時三組大鼠均處死，取腎臟組織冷凍保存。應用RNA提取液提取總RNA。按試劑盒說明合成cDNA。設計MK正向和反向引物:上游5′－CCTGCAACTGGAAGAAGGAG－3′，下游 5′－CTTTGGCCTTTGACTTGGTC－3′，擴增產物片段長度為 189 bp。內參照 β－actin 引物序列上游 5′－GGGAAATCGTGCGTGACAT－3′，下游 5′－GTTCTAGTAACCAGGAGGACT－3′，擴增產物片段長度為 385 bp。RT－PCR反應循環擴增條件為94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s;循環35個周期，72℃延伸3 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察，拍照。應用密度系統分析電泳帶的密度。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件，數據資料以±s表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數采用t檢驗。

2 結果

2.1 第12周時各指標比較 2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組空腹血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數均明顯高于對照組，結果有統計學意義(P＜0.05);2型糖尿病吸煙組各指標也明顯高于2型糖尿病非吸煙組，結果有統計學意義(P＜0.05)。2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組尿白蛋白定量明顯高于對照組，結果有統計學意義(P＜0.05);2型糖尿病吸煙組尿白蛋白定量也明顯高于2型糖尿病非吸煙組，結果有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 第12周時三組空腹血糖、胰島素及尿白蛋白比較(±s)

表1 第12周時三組空腹血糖、胰島素及尿白蛋白比較(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與2型糖尿病非吸煙組比較:2)P＜0.05

組別 n 空腹血糖(mmol/L) 空腹胰島素(mU/L) 胰島素抵抗指數 尿白蛋白(μg/dl)20 5.03±0.03 9.44±1.34 2.25±0.08 57.31±5.842型糖尿病非吸煙組 20 9.22±0.041) 21.13±2.171) 8.04±0.281) 284.25±19.731)2型糖尿病吸煙組 20 11.01±0.111)2) 25.65±3.531)2) 12.53±1.561)2) 791.37±9.951)2)正常對照組

2.2 第12周時三組大鼠腎臟組織PCR法檢測MK表達 2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組MK表達均明顯低于對照組。2型糖尿病非吸煙組MK表達較對照組下調4.5倍，2型糖尿病吸煙組較對照組下調10.7倍，結果均有統計學意義(P＜0.05)，且與三組尿白蛋白水平呈顯著負相關(相關系數為－0.813，P ＜0.01)。見圖1。

1:Marker;2:對照組;3:2型糖尿病非吸煙組;4:2型糖尿病吸煙組

3 討論

世界范圍內，吸煙是人類的一個重要死亡原因〔5〕。吸煙與腫瘤、心腦血管疾病、高血脂、糖尿病等疾病發病均有重要關系〔6～8〕。流行病學調查顯示，戒煙成功可降低人群死亡率，但既往吸煙史帶來的不良影響仍會持續數年，糖尿病患者表現更為明顯〔9，10〕。

吸煙通過多種機制影響糖尿病及其并發癥的發生發展，包括胰島素抵抗、胰島β細胞損傷、氧化應激等〔11，12〕。吸煙對腎臟的損傷主要包括影響腎臟及全身血流動力學、影響水和電解質排泄、影響近曲小管功能、影響血小板及內皮素的功能等〔13〕。本研究通過高糖高脂飼料喂養及靜脈注射STZ誘導方法成功制備出2型糖尿病大鼠模型，并通過測量尿白蛋白定量確定糖尿病腎病。研究發現，實驗12 w時2型糖尿病非吸煙組大鼠的尿蛋白定量明顯高于對照組，吸煙2型糖尿病大鼠的尿蛋白定量明顯高于2型糖尿病非吸煙組和對照組，說明吸煙確實能夠促進糖尿病腎病的發生發展。

糖尿病腎病的發病機制非常復雜，與其相關的基因主要包括:與糖、脂代謝相關的基因、與高血壓血流動力學相關的基因、與胰島素敏感性相關的基因、與信號轉導相關的基因等。其中腎素－血管緊張素相關基因長期引起人們的關注。MK是一種典型的分泌蛋白，其基因主要在腎臟表達，與多效營養因子共同組成肝素營養因子家族。MK在不同種屬間高度保守，人的MK基因位于染色體11q11.2，介于二酰甘油Z基因和毒蕈樣乙酰膽堿受體4基因之間〔14〕。人和鼠MK氨基酸序列有87%同源性。研究發現，MK在神經生長、血管生成、腫瘤發生、組織修復等方面具有豐富的生物學功能，近年來研究發現MK參與腎素－血管緊張素系統的調節，通過抑制腎素－血管緊張素系統活性對腎臟起到保護作用〔15～18〕。本研究中第12周時取三組大鼠腎臟組織，PCR法檢測MK表達。2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組MK表達均明顯低于對照組，而2型糖尿病吸煙組較2型糖尿病非吸煙組MK表達減低更加明顯，與尿白蛋白定量存在相關性，說明腎臟組織中MK的表達下降與糖尿病腎病的發生發展相關且吸煙加重了這種作用機制。吸煙可能通過減低腎臟組織中MK的表達水平進而影響腎素－血管緊張素系統活性，促進2型糖尿病腎病的進展。已有研究發現，MK可通過蛋白激酶C通路、磷脂酰激醇－3激酶通路及有絲分裂原活化蛋白激酶通路等信號轉導發揮作用，也可直接作用于細胞而發揮作用〔17，19〕。下一步研究應關注MK對糖尿病腎病作用的具體機制，為臨床治療提供思路，以及進一步探究吸煙對糖尿病腎病發生發展的作用機制。

通過本研究得出結論，MK在2型糖尿病腎病的發病中發揮作用，吸煙可以通過降低MK的表達進一步加重糖尿病腎病的發展。因此，積極倡導廣泛戒煙，養成良好生活方式，對早期預防2型糖尿病腎病發生具有積極意義。

1 Yang SH，Dou KF，Song WJ.Prevalence of diabetes among men and women in China〔J〕.N Engl J Med，2010;362(25):2425－6.

2 Sairenchi T，Iso H，Nishimura A，et al.Cigarette smoking and risk of type 2 diabetes mellitus among middle－aged and elderly Japanese men and women〔J〕.Am J Epidemiol，2004;160(2):158－62.

3 Amin KA，Awad EM，Nagy MA.Effects of panax quinquefolium on streptozotocin－induced diabetic rats:role of C－peptide，nitric oxide and oxidative stress〔J〕.Int J Clin Exp Med，2011;4(2):136－47.

4 Zadeh－Vakili A，Tehrani FR，Hosseinpanah F.Waist circumference and insulin resistance:a community based cross sectional study on reproductive aged Iranian women〔J〕.Diabetol Metab Syndr，2011;3(1):18.

5 Karter AJ，Stevens MR，Gregg EW，et al.Educational disparities in rates of smoking among diabetic adults:the translating research into action for diabetes study〔J〕.Am J Public Health，2008;98(2):365－70.

6 Park SL，Bastani D，Goldstein BY，et al.Associations between NBS1 polymorphisms，haplotypes and smoking－related cancers〔J〕.Carcinogenesis，2010;31(7):1264－71.

7 Luo TY，Lei T，Liu XH，et al.Status quo and factors influencing smoking cessation in cigarette smoking patients with coronary artery disease〔J〕.Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi，2011;39(5):406－9.

8 Yeh HC，Duncan BB，Schmidt MI，et al.Smoking，smoking cessation，and risk for type 2 diabetes mellitus:a cohort study〔J〕.Ann Intern Med，2010;152(1):10－7.

9 MacLeod SL，Chowdhury P.The genetics of nicotine dependence:relation－ship to pancreatic cancer〔J〕.World J Gastroenterol，2006;12(46):7433－9.

10 Chowdhury P，Udupa KB.Nicotine as a mitogenic stimulus for pancreatic acinar cell proliferation〔J〕.World J Gastroenterol，2006;12(46):7428－32.

11 Anan F，Takahashi N，Shinohara T，et al.Smoking is associated with insulin resistance and cardiovascular autonomic dysfunction in type 2 diabetic patients〔J〕.Eur J Clin Invest，2006;36(7):459－65.

12 Xie XT，Liu Q，Wu J，et al.Impact of cigarette smoking in type 2 diabetes development〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2009;30(6):784－7.

13 Boor P，Casper S，Celec P，et al.Renal，vascular and cardiac fibrosis in rats exposed to passive smoking and industrial dust fibre amosite〔J〕.J Cell Mol Med，2009;13(11－12):4484－91.

14 Kadomatsu K，Muramatsu T.Midkine and pleiotrophin in neural development and cancer〔J〕.Cancer Lett，2004;204(2):127－43.

15 Hirota Y，Osuga Y，Koga K，et al.Possible implication of midkine in the development of endometriosis〔J〕.Hum Reprod，2005;20(4):1084－9.

16 Banno H，Takei Y，Muramatsu T，et al.Controlled release of small interfering RNA targeting midkine attenuates intimal hyperplasia in vein grafts〔J〕.J Vasc Surg，2006;44(3):633－41.

17 Hobo A，Yuzawa Y，Kosugi T，et al.The growth factor midkine regulates the renin－angiotensin system in mice〔J〕.J Clin Invest，2009;119(6):1616－25.

18 Ezquerra L，Herradon G，Nguyen T，et al.Midkine，a newly discovered regulator of the renin－angiotensin pathway in mouse aorta:significance of the pleiotrophin/midkine developmental gene family in angiotensinⅡsignaling〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;333(2):636－43.

19 Horiba M，Kadomatsu K，Yasui K，et al.Midkine plays a protective role against cardiac ischemia/reperfusion injury through a reduction of apoptotic reaction〔J〕.Circulation，2006;114(16):1713－20.