擔載絲裂霉素納米纖維對膀胱移行細胞癌T24細胞增殖的抑制作用及對細胞周期相關蛋白的影響

岳 鑫 岳 磊 王 麗 (解放軍第208醫院，吉林 長春 30062)

膀胱癌是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤，不論是發病率還是死亡率均占泌尿系統腫瘤的首位。近年來膀胱癌的發病率有上升趨勢，多數為移行上皮細胞癌。膀胱移行細胞癌的特點是發病率高、復發率高、治療復雜。低劑量絲裂霉素(MMC)化療不但可提高療效，且減輕毒副作用，與常規化療劑量方案比較，其增效減毒作用顯著。本研究以生物降解高分子材料丙交酯己內酯共聚物(PLCL，LA/CL 80∶20，SFDA認證)為載體制備了新劑型，為驗證納米纖維劑型MMC對膀胱癌細胞的生物學活性，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人膀胱移行細胞癌細胞株T24購自武漢博士德公司。

1.1.2 可生物降解MMC納米纖維片 采用電紡絲技術制備載有MMC生物降解丙交酯/己內酯共聚物納米纖維。藥物擔載濃度為5%(質量百分比濃度)。MMC購于浙江海正藥業股份有限公司(純度＞99%)。

1.2 方法

1.2.1 人工計數法 所選T24細胞以4×105細胞/ml制備細胞懸液;然后選用24孔培養板接種細胞。將擔載MMC的可生物降解載藥納米紗布剪成不同質量的小片，分別為2、4、8 mg，加入不同質量的小片于T24細胞的培養板孔中，日消化細胞3復孔，消化時間為第1、2、3、4、5 天，臺盼藍染色后，使用光學纖維鏡及血細胞計數板對受試細胞進行計數。

1.2.2 四唑鹽(MTT)比色法 選用生長狀態良好的T24細胞，用0.25%胰酶消化為單細胞懸液，調整濃度至5×104/ml，接種于96孔培養板內，每孔200 μl，培養24 h后，加入不同重量的擔載MMC的納米纖維(質量分別為1、2、4、8 mg)，同時需設對照組。每組做3復孔。培養12、24、36、48 h和72 h后取出置96孔細胞培養板，在每孔內加入 20 μl MTT(濃度20 mg/ml)，放入培養箱內繼續培養;4 h過后，將培養板取出，將細胞內MTT與線粒體酶發生反應后形成的藍紫色結晶物于倒置光學顯微鏡下進行觀察;上清液棄掉，每孔內加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，水平搖床振蕩10～15 min;用酶標儀在490 nm波長下測定其吸光度(OD)值。細胞存活率公式:給藥組OD/對照組OD×100%。

1.2.3 Western印跡檢測各種蛋白表達 T24細胞鋪板:取傳代后狀態好的細胞接種于直徑6 cm培養皿中，將其放于5%CO2，37℃的飽和濕度培養箱，時間為24 h。藥物處理培養細胞:吸除培養液后，加入不同重量的(2、4 mg和8 mg)擔載MMC的納米纖維，持續培養細胞48 h。刮取不同質量組別細胞，對細胞的總蛋白進行提取并定量后，對(1)細胞周期素依賴激酶(cyclin dependent kinase4，CDK4);(2)細胞周期素依賴性激酶抑制劑-1(WAF1/p21);(3)細胞周期蛋白(cyclin D1)的含量變化進行研究，Western印跡檢測后，用底片掃描儀掃描X光膠片，通過凝膠成像系統對目的電泳條帶進行解讀，并通過Bandscan軟件進行密度掃描。對照抗體見表1。

表1 抗體稀釋濃度表

2 結 果

2.1 擔載MMC的納米纖維片對T24細胞增殖的抑制作用細胞計數法與空白對照組相比，2、4、8 mg的擔載MMC的納米纖維在24 h后都顯著地降低了T24細胞數目。以72 h為例，由525×104個/ml分別降低為470×104個/ml(2 mg)、425×104個/ml(4 mg)和350×104個/ml(8 mg)。見圖1。

圖1 擔載MMC的納米纖維片對T24細胞數目的影響

2.2 MTT比色法檢測擔載MMC的納米纖維片對T24細胞增殖的抑制作用 經擔載MMC的納米纖維片處理3 d的T24細胞OD值顯著下調，并以劑量-時間依賴的方式，存在顯著性差異(P＜0.05)。見圖2。

圖2 擔載MMC的納米纖維片對T24細胞增殖的抑制作用

2.3 擔載MMC的納米纖維片對T24細胞周期相關蛋白的影響

擔載MMC的納米纖維以劑量依賴方式顯著升高了WAF1/p21的表達，而使CDK4和cyclin D1的表達降低。見圖3。

圖3 擔載MMC的可生物降解載藥納米紗布片對T24細胞WAF-1/p21、Cyclin D1和Cdk4含量的影響

3 討論

MTT比色分析法不僅操作簡單，而且實驗結果的可靠性高，故而可作為了解藥物與腫瘤細胞之間作用機制研究的手段之一。本文通過對比擔載MMC的可生物降解載藥納米纖維對照組和藥敏組腫瘤細胞的數量，可以檢測出藥物對腫瘤細胞的生存率所產生的影響。T24細胞作為多種實驗中測試的腫瘤細胞樣本，用途廣泛，來源于老年白人女性，20 h為其細胞倍增時間〔1〕，但作為擔載MMC納米纖維的受試細胞(膀胱癌T24細胞)，研究者們未曾涉足。本實驗結果顯示，擔載MMC的納米纖維片可以顯著地抑制T24細胞增殖，并且為時間-濃度依賴性方式。

p53在轉錄水平上能夠激活WAF-1/p21。在由p53調控的因DNA損傷而使細胞停頓于G1期的反應中，p21發揮效應基因的作用;p21可結合和抑制增殖細胞核抗原(PCNA)，進而抑制DNA的復制及DNA多聚酶，使損傷的DNA在復制前修復功能。在G1期發揮調控作用的主要是cyclin D及其結合分子CDK4 和 CDK6〔2～4〕。cyclin D1-CDK4-pRb 通路在細胞由 G1期躍遷至S期起到關鍵作用。cyclin D1和CDK4被證實在腫瘤的發生中起重要作用，并被認為可能是判斷腫瘤預后的重要因子和治療靶點〔5，6〕。

本實驗的重點研究領域是檢測下述各項指標:WAF-1/p21，CDK4，cyclin D1。結果表明:擔載MMC的可生物降解載藥納米紗布片以劑量依賴的方式顯著地提高WAFl/p21表達，而使CDK4及cyclin D1蛋白表達下降。結合本研究考慮，擔載MMC的納米纖維片可使G1期阻滯，其原因可能是其上調了WAF1/p21的表達，下調了CDK4和cyclin D1的表達。

1 魏樹禮，李志芳，高智慧，等.絲裂霉素C白蛋白微球的研究〔J〕.北京醫科大學學報，1990;22(3):201.

2 Liang CM，Tai MC，Chang YH，et al.Glucosamine inhibits epidermal growth factor-induced proliferation and cell-cycle progression in retinal pigment epithelial cells〔J〕.Mol Vis，2010;16:2559-71.

3 Peng J，Zhu Y，Milton JT，et al.Identification of multiple cyclin subunits of human P-TEFb〔J〕.Genes Dev，1998;12(5):755-62.

4 Rickert P，Seghezzi W，Shanahan F，et al.Cyclin C/CD8 is a novel CTD kinase associated with RNA polymerase〔J〕.Oncogene，1996;12(2):2631-40.

5 Jia X，Liu B，Shi X，et al.Roles of the ERK，JNK/AP-1/cyclin D1-CDK4 pathway in silica-induced cell cycle changes in human embryo lung fibroblast cells〔J〕.Cell Biol Int，2011;35(7):697-704.

6 Burkhart DL，Wirt SE，Zmoos AF，et al.Tandem E2F binding sites in the promoter of the p107 cell cycle regulator control p107 expression and its cellular functions〔J〕.PLoS Genet，2010;6(6):100-3.