曹 丹 李曉紅 任 艷，＊

曹 丹1，2，李曉紅1，任 艷1

1中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，沈陽110001； 2沈陽市第四人民醫院，沈陽110031

帕金森病（Par kinson Disease，PD）是以黑質紋狀體多巴胺能神經元變性壞死為病理特征的神經系統疾病。近年來研究發現，免疫異常可能與PD的發病機制有關，特別是細胞因子作為免疫炎性反應產物參與該疾病的發生和發展日益受到國內外學者的關注［1］。干擾素－γ（IFN－γ）和白介素－10（IL－10）分別是具有代表性的 Th1型和 Th2型細胞因子，近年來研究發現兩者的比例失調對自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病有著重要作用［2，3］。刀豆蛋白 A （Con A）是一種植物血凝素，能在體外激活非特異性T細胞絲裂原，對調節機體免疫反應具有重要作用。已有作者使用Con A來活化PD患者外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），在一定程度上調節了機體的免疫反應［4］，進一步證實免疫機制參與了PD的發病。目前國內外對PD患者外周血中細胞因子作用的研究報道不一致。因此，本文收集PD患者PBMC進行體外Con A刺激培養，分析其上清液中IL－10和IFN－γ的濃度變化，借以探討 Th1／Th2細胞因子在PD發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 對象與分組

23例PD患者均為本院神經內科門診和住院患者，并符合文獻診斷標準［5］。采用改良Hoenh and Yahr Scale分級量表（HYS）將患者病情分為I～Ⅴ期，并據此分為兩組，即早中期組（I～Ⅲ期）和晚期組（Ⅳ～Ⅴ期）。早中期組患者12例（男6例，女6例），病程4個月～5年；晚期組患者11例（男6例，女5例），病程5年～10年。健康對照組20例（男10例，女10例），年齡55～75歲，均來自本院健康體檢中心。三組間年齡、性別差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑和儀器

Con A購自美國Sig ma公司。精確稱取Con A粉劑 用 RPMI－1640 液 配 制 成 10μg／ml溶 液，0.22μM濾膜過濾滅菌，4℃保存備用。人IFN－γ和IL－10檢測試劑盒購自武漢博士德公司；酶標儀為瑞士SUNRISE RC。

1.3 外周血PBMC提取

參照有關文獻［6］，于清晨6∶00～8∶00空腹狀態下采取各組受試者肘靜脈血5 ml，以密度梯度離心法提取PBMC。即在所取靜脈血中加入Hank’s緩沖液和淋巴細胞分離液（比重1.077），收集血漿與淋巴細胞分離液交界處PBMC，將其懸浮于含0.05%（g／ml）小牛血清的RPMI－1640中，用臺盼藍染色計數活細胞數＞95%，用含小牛血清的RPMI－1640溶液均勻稀釋至2.5×106／ml后，加入24孔板中。以普通培養基（RPMI－1640）和Con A（終濃度10μg／ml［7］）培養基（RPMI－1640＋ Con A）分別對各組PBMC進行培養，即置于37℃、5%CO2孵箱內孵育48h。離心取上清液，于－80℃冰箱內凍存。

1.4 IL－10和IFN－γ檢測

于37℃水浴箱內解凍各組上清液，采用ELISA分別測定各組兩種培養上清液中IL－10及IFN－γ水平。檢測過程嚴格遵照試劑盒說明書進行操作。酶標儀檢測吸光度（OD）后，計算IFN－γ或IL－10濃度。

1.5 統計學處理

所有數據采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析。同組樣本的不同培養方法之間作配對t檢驗，分組樣本同一培養方法之間行組間t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 體外培養PBMC分泌IL－10濃度檢測結果

對照組和早中期組PD 患者PBMC在Con A培養條件下分泌IL－10水平高于普通培養，差異有統計學意義（P＜0.05）；晚期組普通培養的PBMC分泌IL－10水平最低，受Con A刺激培養亦無顯著增加（P＞0.05）。與對照組相比，早中期組PBMC在兩種培養條件下分泌IL－10水平均有升高，但無統計學差異（P＞0.05）。而晚期組與早中期組相比均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1和圖1。

表1 各組PBMC普通培養和Con A培養條件下分泌IL－10和IFN－γ水平比較（±s，pg／ml）

表1 各組PBMC普通培養和Con A培養條件下分泌IL－10和IFN－γ水平比較（±s，pg／ml）

注：與組內普通培養比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與對照組同種培養比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01；與早中期組同種培養比較，5）P＜0.05，6）P＜0.01

細胞因子 對照組（n＝20）普通培養 Con A培養早中期組（n＝12）普通培養 Con A培養晚期組（n＝11）普通培養 Con A培養IL－10 5.82±3.74 7.87±3.211） 7.14±2.63 10.02±4.071） 3.81±1.046） 5.25±2.596）IFN－γ 202.32±30.68 323.63±37.77 1） 282.32±41.86 3） 721.43±65.73 2）4） 221.72±36.24 5） 414.63±40.69 1）6）

圖1 各組培養PBMC分泌IL－10水平比較

圖2 各組培養PBMC分泌IFN－γ水平比較

2.2 體外培養PBMC分泌IFN－γ濃度檢測結果

各組PD患者PBMC分泌IFN－γ水平Con A培養比普通培養升高（P＜0.05，P＜0.01）。早中期組Con A培養的IFN－γ濃度最高，顯著高于晚期組和對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），晚期組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。見表1和圖2。

3 討 論

越來越多的證據表明，PD發病與細胞免疫異常有關。Bogdan等［8］對PD患者外周血淋巴細胞進行了研究，發現其IL、TNF－α和INF－γ分泌比正常健康人顯著提高，Bongioanni等［9］研究證實PD患者外周血淋巴細胞上細胞因子的受體表達異常，還有一些關于外周血淋巴細胞亞群的研究也提示PD患者外周血中存在T細胞異常激活［10］以及淋巴細胞亞群比例失調的現象［3，11］。活化T細胞分泌的Th1／Th2兩種類型的細胞因子中，Th1主要包括IL－2、IFN－γ、IL－12等，而 Th2包括IL－4、IL－10等。Con A是一種植物凝集素，可直接誘導靜息T細胞活化、增生、分化，繼而激活細胞因子引發炎癥反應，調控機體免疫反應。

本研究選取23例PD患者，根據其病情進行分期，檢測其PBMC在Con A誘導培養時的IL－10和IFN－γ分泌水平。結果發現與對照組相比，早中期患者普通培養PBMC分泌IL－10有所增加，IFN－γ增加較多（P＜0.05），Con A刺激培養后的IFN－γ增加最明顯（P＜0.01）。提示早期PD患者外周免疫系統已存在異常現象，表現為外周免疫細胞分泌抗炎因子基礎水平上升，受Con A刺激后進一步升高，而抑炎因子基礎水平也有所升高，刺激后升高明顯，從而發揮一定的炎癥調控作用，表明早期PD外周免疫系統存在異常激活和炎癥，此時免疫細胞具備一定調節能力。因此推測外周免疫系統的過度激活參與了PD的早期發病過程，如果能在此時加強免疫調控，有可能對PD病情進展實現有效干預。而PD晚期免疫系統功能進一步紊亂，體外培養PBMC分泌IL－10水平低于健康對照組（P＜0.05），Con A刺激后亦無顯著變化，表現為抑炎因子下降，并對刺激反應不靈敏，提示免疫系統調控能力進一步下降，抑炎系統分泌抑炎因子拮抗炎癥的能力喪失殆盡。而IFN－γ在PD晚期基礎水平表達與對照組相近，當PBMC受到Con A刺激后，分泌IFN－γ顯著增加。提示PDⅣ～Ⅴ期患者的PBMC激活進入衰退期，對有絲分裂原的刺激只存在有限的反應能力。但由于基礎水平下降，外周免疫細胞參與、啟動免疫反應的能力與早期相比明顯下降。PD晚期外周免疫功能全面下降和失衡，對腦內神經變性進展的參與能力也同樣下降，腦內神經變性繼續加重。

總之，PD的發病機制復雜，T細胞介導的自身免疫系統的紊亂在PD發生發展中起著重要的作用。以往研究證實，多種細胞因子參與PD的進程，Mizuta等［12］研究發現早期IFN－γ濃度增加可能有助于延緩疾病的進程。因此，對PD進行早期免疫反應干預可能對病程進展起延緩作用。

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