多重PCR檢測肺炎鏈球菌血清型方法及臨床應用＊

吳麗娟 鄒建話 劉小月 鄭 磊 王 前

吳麗娟1，2，鄒建話1，劉小月1，鄭 磊3，＊，王 前3，＊

1 廣東省深圳市寶安區婦幼保健院檢驗科，深圳518133； 2南方醫科大學檢驗系，廣州510515； 3南方醫科大學南方醫院檢驗科，廣州510515； ＊通訊作者

肺炎鏈球菌（Streptococcus Pneumonia，SP）是全球兒童社區獲得性感染的首要病原菌，既可導致兒童膿胸、敗血癥、腦膜炎等侵襲性感染，也可導致中耳炎（SP占30%～60%）、肺炎（SP占30%～50%）等呼吸道感染。我國每年因SP相關性疾病導致兒童死亡人數列全球前10名［1］。SP細胞外的多糖莢膜是其致病的關鍵，同時也是疫苗作用的靶點，根據莢膜多糖的不同，已經鑒定出46個血清群，93個血清型。SP的血清型既與致病性、耐藥性有關，也與莢膜置換、疫苗有效性有關，是相關研究的核心［2］。由丹麥國家血清研究院（Statens Serum Institut，SSI）提供的莢膜腫脹法和乳膠凝集法是傳統方法檢測SP血清型的金標準［3］，但其抗血清昂貴，不能自動化及批量檢測。由于90多種血清型的莢膜多糖基因序列（cps）的公布，分子分型技術有望替代傳統方法，更簡單快捷地檢測SP血清型［4］。本研究旨在建立一種簡易的血清型多重PCR（mPCR）方法，檢查幾種常見重要SP血清型（4、6、9 V、14、18、19F、23F、19 A），通過檢測相應已知血清型和未知血清型臨床菌株并與測序結果比較，以初步探討該方法的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

1.1.1 已知血清型SP菌株：4、6、9 V、14、18、19F、23F、19 A（北京大學人民醫院惠贈）各1株，血清型由SSI莢膜腫脹法確定。

1.1.2 未知血清型SP菌株：分離自2009年1月～2011年12月深圳市某區婦幼醫院兒科患兒不重復SP菌株126株［5］，其中16株來源于血液，其它來源于呼吸道，用苛氧菌菌種保存管（MAST，英國）－70℃保存。SP鑒定標準為奧普托欣紙片敏感和膽汁溶菌試驗陽性。

1.1.3 質控菌株：選取標準菌株ATCC49619（已知血清型為19F）作為質控菌株。

1.2 實驗試劑與設備

二氧化碳培養箱（Shellab，美國）；Axygen細菌基因組DNA小量提取試劑盒（美國）；Taq DNA聚合酶、d NTP Mix、10×Loading Buffer、DNA Mar ker（Ta Ka Ra公司，日本）；瓊脂糖（Biowest公司，法國）；溴化乙錠等常規分子生物學試劑（南方醫科大學檢驗系提供）；TA載體試劑盒（上海拜力公司）；瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（Ta Ka Ra公司，日本）；PCR擴增儀（Eppendorf，德國）；凝膠電泳成像分析系統（Bio－rad，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計：參照文獻［6］，根據廣泛應用的SP 7價結合疫苗覆蓋血清型及近年來常見的19 A血清型，設計9對PCR引物，包括SP莢膜多糖基因的保守序列cpsA，血清型4、6、9 V、14、18、19 A、19F、23F特異性引物，由Invitrogen公司合成，各引物序列見表1。

1.3.2 DNA提取、PCR擴增：將凍存的SP臨床菌株復蘇，重傳至羊血平板（廣州迪景），置5%CO2、35℃溫箱孵育18～24h。將新鮮純SP菌落刮入1 ml生理鹽水，按Axygen細菌基因組DNA小量提取試劑盒（柱提取法）步驟提取模板DNA。PCR反應體系為Ex Taq DNA 聚合酶0.1μl，10×Ex Taq buffer 2μl，模板 DNA 2μl，d NTPs 1.6μl，9種混合引物（每種引物 200μM）0.75μl，重蒸水補足至20μl。循環參數：94℃15 min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，35個循環，72℃10 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠電泳成像系統觀察產物條帶。

表1 8種特異性SP血清型引物序列

1.3.3 DNA測序：在紫外燈下切割有條帶的膠塊，按DNA純化試劑盒說明書對DNA進行純化后，按TA載體試劑盒說明書與p MD18－T載體進行連接，平板克隆。完成后送華大基因公司測序，測序結果經Blast檢索與Gen Bank數據庫進行同源性比較分析。

2 結 果

2.1 8株已知血清型SP DNA經mPCR擴增后結果

每株SP都能擴增出cpsA特異性產物，同時每種血清型均在對應的產物大小位置出現特異性條帶，血清型18和19 A由于產物大小太接近，無法直接區別，需克隆后測序區分；產物測序結果與mPCR結果一致。見圖1。

圖1 已知血清型SP經mPCR擴增后電泳圖

2.2 126株未知血清型臨床SP DNA經mPCR擴增后結果

共有124株SP能擴增出cpsA特異性條帶，14株血液來源SP有特異性條帶，檢出5種血清型，35株呼吸道來源SP有特異性條帶，檢出8種血清型（表2）。所有血清型特異性條帶均經過純化克隆后測序驗證，結果顯示與mPCR結果一致。

表2 126株臨床SP血清型檢出率（n，%）

3 討 論

cps基因座上的莢膜多糖合成基因決定SP莢膜多糖的產生，其開始部位的基因序列cpsA高度保守，幾乎可出現在所有SP中，除外不能分型的SP（無莢膜），cps基因座中心部位的位點包含血清型特異性基因，可作為分子分型的基礎［4］。本文設計的mPCR引物針對最常導致侵襲性感染（血流感染）的8種SP血清型的cps保守序列，通過mPCR檢測的8種SP血清型與傳統方法檢測的血清型均一致，可以直接通過產物大小區分特異性血清型，無交叉反應，cpsA可作為內參。表明該方法可簡單、直接地區分8種血清型。

SP通過兩種不同方式對人體致病：一是侵襲性菌株通過有效的人類個體間傳播導致菌血癥；二是菌株長期定植在鼻咽部，伺機導致呼吸道感染。因此出現侵襲性感染和呼吸道感染SP血清型的不同流行分布特點。全球范圍內，13種SP血清型導致了超過75%的兒童侵襲性SP感染（血流感染）［1］，我國Lian等［3］用傳統方法檢測兒童血液來源SP血清型發現87.8%的菌株分布在這13種血清型中，尤以血清型19F、14、19A、6和23F最常見。與本研究中血液來源SP 87.50%分布在19F、14、19 A、6和23F相一致，表明mPCR對血液來源SP血清型檢測有較高的應用價值，通過一次mPCR即可檢測出絕大部分菌株的血清型，簡單有效。

本文結果顯示本方法對呼吸道來源樣本SP的血清型檢出率顯著低于血液樣本，只有31.81%的樣本出現特異性條帶，這與呼吸道SP血清型異質性大，分布更廣有關，僅用一次mPCR不能達到檢測目的。對此可采用 Karen等［7］設計的一系列mPCR實驗，逐步完成對所有呼吸道樣本SP血清型的篩查。

mPCR分子分型法檢測SP血清型不用購買昂貴的血清型抗血清，又能達成準確、簡單、高通量檢測血清型。同時，mPCR還可應用于呼吸道多種血清型SP混合定植的篩查，這是傳統方法無法做到的。總之，本文建立的mPCR檢測SP血清型方法可簡單、直接地檢測出8種SP重要血清型，尤其對于血液來源SP血清型有較大優勢，至于呼吸道SP血清型檢測尚需完善更多mPCR方案。

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3 Lian X，Kaihu Y，Guilin X，et al.Serotype distribution and antimicr obial resistance of Streptococcus pneumoniae isolates that cause invasive disease among Chinese children［J］.Clin Infec Dis，2010，50（5）：741～744.

4 Stephen DB，David MA，Angeliki M，et al.Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal ser ot ypes［J］.PLoS Genet，2006，2（3）：e31.

5 吳麗娟，鄒建話，繆小佟，等.社區獲得性呼吸道感染患兒肺炎鏈球菌耐藥特征分析［J］.中國實驗診斷學，2011，15（12）：2 147～2 149.

6 Rekha Pai，Robert EG，Ber nard B，et al.Sequential multiplex PCR approach for deter mining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates［J］.J Clin Micro，2006，44（1）：124～131.

7 Karen M，Carolynn DB，Marcella H，et al.Serotyping of streptococcus pneumoniae isolates from nasopharyngeal samples：use of an algorit h m combining microbiologic，ser ologic，and sequential multiplex PCR techniques［J］.J Clin Micr o，2011，49（9）：3 209～3 214.