泄濁除痹方總黃酮對小鼠腎小管上皮細胞增殖與尿酸吸收的影響Δ

吳新榮，臧路平，劉志剛，孫維峰（廣州軍區廣州總醫院藥劑科，廣州 510010）

高尿酸血癥（Hyperuricemia）是指血液中的尿酸濃度高于正常水平的一種機體狀態，其進一步發展會導致痛風。痛風是一種關節炎癥，表現為關節處或者關節周圍形成尿酸單鈉結晶，促使急性炎癥的發作和長期的組織損傷。痛風的長期治療途徑為降低血清和組織中的尿酸濃度。

腎小管上皮細胞（Renal tubular epithelial cells，RTECs）上固定的各種轉運體負責腎臟物質的轉運，其中尿酸在腎臟中的重吸收作用主要依賴于近端小管上皮細胞膜上表達的尿酸鹽陰離子轉運體（URAT1）[1]。

泄濁除痹方是多年來臨床治療高尿酸血癥的經驗方，臨床試驗表明，該處方對高尿酸血癥有良好的治療作用[2]。為進一步明確該處方中的主要活性成分，本課題組對其有效部位進行了分離[3]。總黃酮是在泄濁除痹方中提取出的有效部位之一，已有文獻報道黃酮類化合物對尿酸吸收的影響[4]。本文在此研究基礎上，探討泄濁除痹方總黃酮體外刺激小鼠RTECs對其尿酸吸收功能的影響，為該藥降尿酸機制的研究和新藥的開發提供新的理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超凈工作臺（江蘇蘇凈集團有限公司）；CO2培養箱（美國Thermo Forma公司）；CKX41熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；68酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

泄濁除痹方顆粒（廣州軍區廣州總醫院藥劑科，批號：101118）；DMEM/F12培養基、D-Hanks、胎牛血清（美國Hyclone公司）；人轉鐵蛋白、牛胰島素、表皮生長因子、percoll細胞分離液、尿酸、尿酸檢測試劑盒、MTT（美國Sigma公司）；I型膠原酶（美國Gibco公司）；青霉素（0.48 g∶80萬u）、鏈霉素（0.96 g∶160萬u））購自湖北遠成藥業有限公司；鼠抗人細胞角蛋白18抗體、羊抗鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；二甲亞砜（DMSO，廣州化學試劑廠）；苯溴馬隆（德國赫曼大藥廠）。

1.3 動物

3～5周SPF級昆明種小鼠，♂，體重（18±2）g，由廣州軍區廣州總醫院動物實驗中心提供（動物使用合格證號：粵檢證字第2006B020號）。

2 方法

2.1 泄濁除痹方總黃酮的制備

泄濁除痹方顆粒粉碎后，60%乙醇回流提取3次，總黃酮粗提液經聚酰胺顆粒靜態吸附2 h達到平衡后，先以水洗脫，繼以乙醇洗脫，得到的總黃酮含量達71.84%。

2.2 小鼠RTECs的原代培養與鑒定

用優化好的方法對目的細胞進行原代培養：處死小鼠后立即無菌取腎，去除包膜及脂肪組織，取皮質部分，剪碎，消化，過篩，于37℃、5%CO2孵育箱培養。待細胞長滿后用0.25%胰蛋白酶處理細胞并進行傳代培養。制備細胞爬片，用細胞角蛋白18多克隆抗體（1∶250）為一抗[5]，羊抗鼠IgG為二抗，進行SP法染色鑒定。

2.3 泄濁除痹方總黃酮對RTECs增殖活性的影響

取3～5代RTECs，用2.5%的胰蛋白酶消化后再用含10%FBS的DMEM培養液制成1×105個/mL的細胞懸液，加入96孔板，每孔100 μL，置于培養箱中培養，12 h使其貼壁后棄上清液，加入不同濃度的總黃酮（0、0.5、2.5、5.0、7.5、10.0 g·L－1）DMEM培養基，培養48 h，終止培養前4 h每孔加入MTT（5 g·L－1）20 μL，培養結束后棄上清液，加入DMSO（100 μL）震蕩后于酶標儀490 nm波長處測定吸光度（A），結果以5個復孔的均值表示，參考MTT法公式計算增殖率。根據試驗結果選擇對細胞生長影響沒有統計學意義的濃度范圍，進行下一步尿酸吸收試驗。

2.4 泄濁除痹方總黃酮對RTECs尿酸吸收的影響

將細胞接種到96孔板，在室溫下進行尿酸吸收30 min。尿酸吸收試驗培養基成分為[6]：NaCl 137 mmol·L－1、KCl 5 mmol·L－1、K2HPO40.1 mmol·L－1、MgSO41.8 mmol·L－1、葡萄糖20 mmol·L－1、HEPEs 10 mmol·L－1（pH 7.4）。設定尿酸吸收取樣時間點分別為0、15、30、45、60、75、90 min。吸收結束后，使用尿酸檢測試劑盒檢測培養基中剩余尿酸濃度，顯色后，490 nm波長處檢測A值。差量法計算尿酸吸收值，確定試驗取樣時間點。

取3～5代RTECs，用2.5%的胰蛋白酶消化后再用含10%FBS的DMEM培養液制成1×105個/mL的細胞懸液，加入96孔板，每孔100 μL，置于培養箱中培養，12 h使其貼壁后棄上清，根據MTT試驗確定的尿酸吸收試驗濃度，加入不同濃度的總黃酮（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L－1）DMEM培養基，以苯溴馬隆為陽性對照。藥物細胞孵育培養48 h后將培養基吸出，加入尿酸吸收培養基，于培養箱中培養30 min后，各測量孔吸取50 μL樣液，根據尿酸檢測試劑盒測定剩余尿酸濃度，差量法計算尿酸吸收值，并計算藥物作用于尿酸吸收的抑制率，結果以5個復孔抑制率的均值表示。

2.5 統計學方法

采用SPSS統計軟件處理數據，試驗結果以±s表示，組間差異的比較采用單因素方差分析和t檢驗。

3 結果

3.1 小鼠RTECs的原代培養與鑒定

培養約3 d后在腎小管節段邊緣有多邊形細胞呈島嶼狀長出，并逐漸增多向四周呈放射樣生長，至第10天，基本長滿培養瓶底。在倒置顯微鏡下觀察細胞具有鋪路石樣形態特征，細胞較大，排列緊密。細胞免疫組化染色反應顯示抗細胞角蛋白18染色陽性，胞質內見大量棕黃色顆粒，襯染的核呈藍色，純度在90%以上。小鼠RTECs原代培養10 d的情況見圖1；細胞免疫組化圖片見圖2。

圖1 小鼠RTECs原代培養10 d的情況Fig 1 The day 10 of mouse renal proximal tubule epithelial cell primary culture

圖2 細胞免疫組化圖片Fig 2 Cell immunohistochemistry picture

3.2 泄濁除痹方總黃酮對RTECs增殖活性的影響

高濃度泄濁除痹方總黃酮（10～5 g·L－1）能顯著抑制細胞活性，影響細胞增殖（P＜0.01）；低濃度泄濁除痹方總黃酮（2.5～0.5 g·L－1）對細胞的增殖活性幾乎不產生影響。因此，確定2.5～0.5 g·L－1作為尿酸吸收試驗的參考濃度范圍。泄濁除痹方總黃酮對RTECs增殖活性的影響見表1。

表1 泄濁除痹方總黃酮對RTECs增殖活性的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuo chubi decoction on the proliferation of RTECs（±s，n＝5）

表1 泄濁除痹方總黃酮對RTECs增殖活性的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuo chubi decoction on the proliferation of RTECs（±s，n＝5）

與0 g·L－1比較：＊P＜0.01vs.0 g·L－1：＊P＜0.01

濃度/g·L－1 0 0.5 2.5 5.0 7.5 10.0增殖率/%0.421±0.006 0.423±0.005 0.420±0.001 0.100±0.011＊0.010±0.001＊0.013±0.003＊

3.3 泄濁除痹方總黃酮對RTECs尿酸吸收的影響

通過前期試驗確定，尿酸吸收試驗的取樣時間點為30 min，即細胞進行尿酸吸收30 min后，終止吸收試驗，取樣測量培養基中剩余尿酸濃度。因為在該時間點，尿酸吸收速率達到最大且未達到飽和。與未加藥物刺激的RTECs細胞比較，在藥物刺激細胞48 h后，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L－1各濃度對尿酸吸收均有不同程度的抑制作用，其中較高濃度抑制作用較為強烈。泄濁除痹方總黃酮對RTECs尿酸吸收的影響見圖3。

4 討論

尿酸排泄減少是造成高尿酸血癥的一個主要原因，尿酸的排泄量取決于腎小管的分泌作用以及分泌后的重吸收作用。固定在腎臟近端小管上皮細胞管腔側和基底外側膜上的轉運蛋白負責尿酸的分泌和重吸收。

本課題組的前期臨床研究發現，泄濁除痹方對治療高尿酸血癥有一定的療效，為了確定其發揮作用的活性成分，繼而對該藥方進行分離提取，總黃酮是所分離出的有效部位之一。本研究發現，總黃酮在沒有對小鼠RTECs的增殖活性產生影響的前提下，能夠明顯抑制該細胞的尿酸吸收功能。提示總黃酮抑制RTECs的重吸收功能可能是泄濁除痹方治療高尿酸血癥的原因之一，而固定在該細胞上的URAT1是負責尿酸重吸收的主要蛋白，這為高尿酸血癥的治療和機制研究提供了新的理論依據。

圖3 泄濁除痹方總黃酮對RTECs尿酸吸收的影響Fig1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuochubi decoction on the uric uptake of RTECs

[1]Enomoto A，Kimura H，Chairoungdua A，et al.Molecular identification of a renal urate anion exchanger that regulates blood urate levels[J].Nature，2002，59（417）：447.

[2]孫維峰，張嫻嫻，徐 偉.泄濁除弊湯兩種組方對高尿酸血癥患者血尿酸水平的影響[J].華南國防醫學雜志，2009，23（4）：35.

[3]吳新榮，劉志剛，顏仁梁，等.聚酰胺顆粒分離純化土茯苓總黃酮研究[J].中藥材.2009，32（10）：1 606.

[4]Yu Z，Fong WP，Cheng CHK.The dual actions of morin（3，5，7，2′，4′-pentahydroxyflavone）as a hypouricemic agent：uricosuric effect and xanthine oxidase inhibitory activity[J].J Pharmacol Exp Ther，2006，316（1）：169.

[5]毛慧娟，王笑云，徐昌芬，等.人腎近端小管上皮細胞的原代培養、傳代及鑒定方法研究[J].南京醫科大學學報，2004，24（6）：561.

[6]Rochelle Cunningham，Marc Brazie，Srilatha Kanumuru，et al.Sodium-hydrogen exchanger regulatory factor-1 interacts with mouse urate transporter 1 to regulate renal proximal tubule uric acid transport[J].J Am Soc Nephrol，2007，24（18）：1 419.