烏頭堿在豚鼠和小鼠肝微粒體細胞色素氧化酶中的代謝作用研究

謝利霞，呂 昌，葉 玲，唐 斕（1.廣東醫(yī)學院附屬南山醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 51805；.南方醫(yī)科大學藥學院，廣州 510515）

烏頭堿（Aconitine，AC）具有祛寒、止痛等功效，為中醫(yī)和民間常用中草藥。其毒性成分主要損害神經(jīng)和心血管系統(tǒng)，表現(xiàn)為各種類型的心律失常[1]。目前國內(nèi)、外學者已對AC類物質的毒性機制進行了有益探索，如Murayama M等[2]探索了AC類物質的抗炎作用和毒性大小，Xiao K等[3]研究了AC體外對受孕大鼠的胎盤毒性，結果均顯示AC有直接的毒性作用。筆者采用小鼠醋酸扭體法和毒性評價實驗測定得單體AC的安全范圍是0.068 79～0.087 08 mg·kg-1（ED95～LD5），安全范圍相當窄。這種高毒性和狹窄的治療范圍與AC在體內(nèi)的代謝相關。研究表明，AC可被人體重要的Ⅰ相藥物代謝酶系統(tǒng)——細胞色素P450氧化酶（CYP450）系所代謝，生成毒性和藥理活性改變的多個代謝產(chǎn)物，參與體內(nèi)作用[4～6]。但目前僅對AC的代謝轉化途徑和代謝產(chǎn)物在大鼠和人的尿液及肝微粒體中進行過研究，藥物與CYP450的相互作用是藥物產(chǎn)生治療作用和（或）毒性反應的關鍵因素。筆者選擇豚鼠和小鼠肝微粒體在體外研究AC在不同種屬中的代謝特征，并采用超高效液相色譜-多級質譜（UPLC-MS/MS）法測定AC在2個種屬肝微粒體孵育樣品中的代謝產(chǎn)物，分析比較AC代謝轉化途徑和產(chǎn)物生成的種屬差異，以期為AC的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Micromass高分辨質譜（HRMS）儀、AcquityTM高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）；恒溫水浴箱（上海福碼實驗設備有限公司）；超純水制備系統(tǒng)（美國Millpore公司）；NI-2RC渦旋儀（美國熱電儀器公司）；5423高速離心機、移液槍（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

AC（美國LC Laboratories）公司；雙嘧達莫（美國Sigma Aldrich公司）；小鼠和豚鼠肝微粒體、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氯化鎂溶液（NADP，glucose-6-phosphate and magnesium chlo-ride，以下簡稱溶液A）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶枸櫞酸鈉溶液（glucose-6-phosphate dehydrogenase in sodium citrate，以下簡稱溶液B）均購于美國BD公司。

2 方法與結果

2.1 AC供試品母液的制備

精密稱取AC 12.93 mg，置于1.5 mL離心管中，精密吸取200μL二甲基亞砜（DMSO）加入離心管，超聲溶解后精密吸取乙腈800μL加入離心管，渦旋混勻。即制備20 mmol·L-1的AC供試品母液，于－20℃貯藏，備用。

2.2 AC在體外肝微粒體Ⅰ相代謝體系的建立

（1）肝微粒體酶（20μL，10 mg·mL－1）的終濃度控制在約0.4 mg·mL－1，反應體系加入溶液A 50 μL和溶液B 10 μL，整個體系在50 mmol·L－1的PBS溶液中（pH 7.4）。（2）上述混合物置于37℃水浴培養(yǎng)5 min后加入AC供試品母液（20μL，終濃度控制在10μmol·L－1，DMSO終濃度為0.2%），混合均勻；上述混合物（整個體系總體積約為1 000μL）置于37℃水浴培養(yǎng)至30～120 min。（3）將反應系統(tǒng)移入冰浴終止反應，加入50 μmol·L－1雙嘧達莫（100%乙腈溶解）50 μL為內(nèi)標，加入二氯甲烷4 mL，渦旋30 s，樣品離心（3 500 r·min－1）15 min，取出上清液即蛋白層后將二氯甲烷層轉移到另一干凈玻璃管中以氮氣吹干，加入水-乙腈（1∶1）110 μL復溶后離心（13 000 r·min－1）15 min，取上清液供UPLC-MS/MS和HPLC-HRMS分析用。

2.3 UPLC-MS/MS和HPLC-HRMS法鑒定ACⅠ相代謝產(chǎn)物方法

2.3.1 UPLC-MS/MS鑒定ACⅠ相代謝產(chǎn)物方法 （1）UPLC條件：流動相A為0.05%醋酸銨水溶液，流動相B為乙腈溶液（梯度洗脫：0～12 min，90%A～55%A；12～22 min，35%A；22～26 min，0%A；26～30 min，0%A；30～30.1 min，90%A；30～33 min，90%A），流速為0.35 mL·min－1，柱溫為常溫。（2）MS條件：離子源為ESI+，毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為35 V，離子源溫度為110℃，干燥氣（氮氣）溫度為500℃。

2.3.2 HPLC-HRMS法鑒定ACⅠ相代謝產(chǎn)物方法 （1）HPLC條件：流動相A為0.05%醋酸銨水溶液，流動相B為乙腈溶液（梯度洗脫：0～12 min，90%A～55%A；12～22 min，35%A；22～26 min，0%A；26～30 min，0%A；30～30.1 min，90%A；30～33 min，90%A），流速為0.35 mL·min－1，柱溫為常溫。（2）HRMS條件：離子源為ESI，正離子全掃描方式；毛細管電壓為4 500 V，霧化氣壓為1.5 bar（1 bar＝0.1 MPa），干燥氣溫度為200 ℃，氮氣流速為8.0 mL·min－1。

2.4 AC在肝微粒體中代謝物的結構鑒定

2.4.1 AC的裂解規(guī)律 AC結構中有3個羥基，分別在C3、C13和C15位；有4個甲氧基，分別在C1、C6、C16和C18位，C8位取代基為乙酰氧基，C14位取代基為苯甲酰氧基。N上連接的基團為乙基。這些基團都處在AC空間結構的外圍，在電離的過程中容易失去而產(chǎn)生相應的碎片離子。在選定的MSn條件下對AC進行多級串聯(lián)質譜分析。

[M+H－60]+離子為基峰離子（m/z586），經(jīng)研究證實，AC結構中C8的乙酰氧基是這個離子產(chǎn)生的結構基礎。電離過程中，C8的乙酰氧基和鄰近碳上的氫結合，形成一分子乙酸，AC準分子離子丟失質量數(shù)為60 Da的乙酸中性碎片后產(chǎn)生了[M+H－60]+離子。Li R等[6]報道，[M+H－60]+（m/z586）、[M+H－60－32－28]+（m/z526）、[M+H－60－32×3－122]+（m/z368）均為AC的診斷離子。圖1也顯示，這3種診斷離子為AC特有的裂解離子。這將對其代謝產(chǎn)物的鑒定提供依據(jù)。

2.4.2 代謝物的結構鑒定 AC在豚鼠和小鼠體外肝微粒體中進行Ⅰ相代謝酶孵育后，利用UPLC-MS/MS和HPLCHRMS方法，發(fā)現(xiàn)并確證多個代謝產(chǎn)物，結果都相同。

2.4.3 分子量為MW-14的代謝產(chǎn)物：aMD14（[M+H]+m/z632）

AC在肝微粒體中孵育后的UPLC-MS/MS聯(lián)用總離子流圖的基礎上，經(jīng)過提取得到2個m/z632的提取離子流圖。通過高分辨質譜確定他們的元素組成，發(fā)現(xiàn)其分子式為C33H46NO11（表1中M1、M2），所以認為其是同分異構體。以UPLC-MS/MS對各個組分進行MS2研究，同時參考原型藥物的裂解規(guī)律，對2個代謝產(chǎn)物物的結構進行了初步推斷。2個代謝產(chǎn)物m/z632的二級質譜均含有主要的碎片信息m/z572（圖1中B2、C2），比AC相應的碎片離子m/z586低14個質量單位，表明這2個化合物與AC具有相同的碎片的斷裂方式，證明二萜的化學骨架結構是完整的。在前文總結的裂解規(guī)律中提到，對AC進行串聯(lián)，可以發(fā)現(xiàn)MS2譜中基峰離子為m/z586，為丟失乙酸后生成的[M+H－60]+離子。選擇該離子進行串聯(lián)，會產(chǎn)生m/z368的離子[M+H－60－（32×3）－122]+。筆者認為[M+H－60]+離子進一步裂解，先后脫去C1、C6、C16位甲氧基和C14位的苯甲酰氧基，最終形成m/z368的離子。aMD14類代謝產(chǎn)物均比原型藥物少14Da，AC類物質在體內(nèi)生物轉化過程中較容易發(fā)生甲氧基的去甲基化反應。所以，筆者認為這2個化合物為去甲基化產(chǎn)物。如果是C1、C6或C16位發(fā)生了去甲基化反應生成了羥基，由于在裂解的過程中，這些基團會以水的形式脫去，所以形成的仍然還是m/z368的離子；如果丟失亞甲基的不是上述位置，則發(fā)生了改變的基團被保留到最后，最終形成的特征離子的m/z應該是354（368－14）。根據(jù)這個規(guī)律，筆者初步分析去甲基化反應發(fā)生的位置在C1、C6或C16位。研究結果顯示，M2的相對豐度高于M1，考慮電子效應和空間位阻及參照拉巴烏頭堿的代謝規(guī)律[7]，16位甲氧基最易脫掉甲基，因此具有較高豐度且保留時間為2.35 min的M2被鑒定為16-O-去甲基烏頭堿。由于除16位外1、2、18位均含甲氧基且都有可能發(fā)生脫甲基反應，故不能確定脫甲基的具體位置。M1鑒定為O-去甲基烏頭堿。質譜見圖1。

2.4.4 分子量為MW-28的代謝產(chǎn)物：aMD28（[M+H]+，m/z618） 肝微粒體孵育體系中一共發(fā)現(xiàn)2個m/z618的色譜峰。通過高分辨質譜確定他們的元素組成，發(fā)現(xiàn)它們的分子式均為C32H44NO11（表1中M3、M4），認為它們是同分異構體。aMD 28類代謝產(chǎn)物均比原型藥物少28Da，AC類物質在體內(nèi)生物轉化過程中較容易發(fā)生甲氧基的去甲基化反應及N上的去乙基化反應。參考原型藥物的裂解規(guī)律，對2個代謝產(chǎn)物的結構進行初步推斷，認為這2個化合物中一個去掉2個甲基，另一個N位脫掉1個乙基。保留時間為0.96 min的M3有診斷離子m/z558和m/z498，m/z498推測為m/z558脫掉一分子甲氧基（-OCH3）和1分子乙基（-C2H5），只有N上接-C2H5的化合物才可在電子轟擊中脫去此碎片，因此M3為N位脫乙基產(chǎn)物，而另一化合物M4則為脫2個甲基的代謝物。質譜見圖1。

2.4.5 分子量為MW-2的代謝產(chǎn)物：aMD2（[M+H]+m/z644）肝微粒體孵育體系中發(fā)現(xiàn)1個m/z644的色譜峰。通過高分辨質譜確定它們的元素組成，發(fā)現(xiàn)其元素組成為C34H46NO11（表1中M5），aMD2代謝產(chǎn)物比原型藥物少2Da，所以認為此代謝物為AC的脫氫化產(chǎn)物。對各個組分進行MS2研究，記錄各個組分的裂解規(guī)律，比較它們之間的相同點和不同點，同時參考原型藥物的裂解規(guī)律，對次代謝產(chǎn)物的結構進行初步推斷。aMD2的MS2圖出現(xiàn)了典型的診斷離子m/z586，m/z552以及m/z524，則在C15位不可能出現(xiàn)脫氫現(xiàn)象，故代謝產(chǎn)物應為3位脫氫產(chǎn)物。質譜見圖2。

2.4.6 分子量為MW+16的代謝產(chǎn)物：aMD16（[M+H]+m/z662） 肝微粒體孵育體系中發(fā)現(xiàn)2個m/z662的色譜峰。通過高分辨質譜確定它們的元素組成，發(fā)現(xiàn)其中一個的元素組成為C34H48NO12（表1中M6），其余為雜質，aMp16代謝產(chǎn)物比原型藥物多16 Da，所以認為此代謝物為AC的羥化產(chǎn)物。

2.4.7 分子量為MW-16的代謝產(chǎn)物：aMD16（[M+H]+m/z630） 微粒體孵育體系中發(fā)現(xiàn)1個m/z630的色譜峰。通過高分辨質譜確定元素組成為C34H48NO10（表1中M7），aMp16代謝產(chǎn)物比原型藥物少16 Da，所以認為此代謝物為AC的脫氧產(chǎn)物。對其進行MS2研究，記錄其裂解規(guī)律，同時參考原型藥物的裂解規(guī)律，對此代謝產(chǎn)物的結構進行初步推斷。MS2圖譜中顯示了典型的診斷離子m/z510。推測其為3位脫氧產(chǎn)物。

2.4.8 分子量為MW-42的代謝產(chǎn)物：aMD42（[M+H]+m/z604） 肝微粒體孵育體系中發(fā)現(xiàn)2個m/z604的色譜峰。對其進行多級質譜串聯(lián)，在MS2圖中未發(fā)現(xiàn)[M+H－60]+離子，AC的裂解規(guī)律指出，[M+H－60]+離子是由C8位基團脫去所產(chǎn)生的，所以代謝產(chǎn)物結構中AC有的C8位基團一定發(fā)生了改變。AC在水中很不穩(wěn)定，C8位酰鍵極易發(fā)生水解，其水解產(chǎn)物為14-苯甲酰烏頭胺（也稱8-去乙酰烏頭堿），產(chǎn)物與AC相差42 Da，筆者推斷aMD42為AC的水解產(chǎn)物：14-苯甲酰烏頭胺（表1中M8）。質譜見圖2。

表1 烏頭堿在豚鼠和小鼠肝微粒體中代謝產(chǎn)物Tab 1 Metabolites of aconitine in liver microsomes of guinea pig and mice

A1.AC 的MS圖；A2.AC[M+H]+(m/z 646)的MS2圖；B1.M1的MS圖；B2.M1[M+H]+(m/z 632)的 MS2圖；C1.M2的MS圖；C2.M2[M+H]+(m/z 632)的MS2圖；D1.M3的MS圖；D2.M3[M+H]+(m/z 618)的MS2圖；E1.M4的MS圖；E2.M4[M+H]+(m/z 618)的MS2圖Fig 1 Mass chromatogramsA1.MS chromatograms of AC；A2.MS2[M+H]+(m/z 646)of AC；B1.MS chromatograms of M1；B2.MS2[M+H]+(m/z 632)of M1；C1.MS chromatograms of M2；C2.MS2[M+H]+(m/z 632)of M2；D1.MS chromatograms of M3；D2.MS2[M+H]+(m/z 618)of M3；E1.MS chromatograms of M4；E2.MS2[M+H]+(m/z 618)of M4

2.5 代謝物小結

由“2.4”項下分析可知，AC在小鼠和豚鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物一致，都檢測到了8種代謝產(chǎn)物，其中有2個脫甲基產(chǎn)物（M1、M2），1個脫雙甲基產(chǎn)物（M3），1個脫乙基產(chǎn)物（M4），1個脫氫產(chǎn)物（M5），1個羥化產(chǎn)物（M6），1個脫氧產(chǎn)物（M7）和1個水解產(chǎn)物（M8）。從結構上看，其代謝規(guī)律以水解、脫甲基、羥化、脫氫代謝為主，而CYP參與了其中最重要的脫甲基、羥化、脫氫代謝（M1～M6）。AC在豚鼠和小鼠肝微粒體中代謝產(chǎn)物見表1；AC在豚鼠和小鼠肝微粒體中可能的代謝途徑見圖3。

3 討論

研究結果表明，在小鼠和豚鼠肝微粒體代謝系統(tǒng)中AC至少產(chǎn)生了8個代謝產(chǎn)物（M1～M8）。其中M1～M6為CYP異構體參與代謝產(chǎn)生的代謝物，并且O-脫甲基、N-脫乙基、脫氫和加氧反應為最主要的CYP代謝途徑。將這些代謝物的結構與AC比較，顯示僅在其側鏈發(fā)生了變化，表明這些代謝產(chǎn)物可能仍具有藥理活性。構效關系研究顯示，AC的高毒性與以下官能團有關：C8位的乙酰氧基，C13位的羥基，C1、C6、C16、C18位的4個甲氧基以及C24位的苯氧基酯[8]。代謝物M8為C8位乙酰氧基水解的衍生物，其毒性比AC低得多。代謝物M9、M10和M11也同樣去掉了一些使AC毒性增強的官能團，提示經(jīng)微粒體代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能仍具有藥理活性，但毒性會降低。當C8位和C14位上的基團發(fā)生水解形成單酯結構后化合物的毒性會降低，同時其鎮(zhèn)痛和抗心律不齊的藥理作用會顯著增強[7]，因此AC經(jīng)C8位水解形成的單酯結構代謝物M8，與AC相比，藥理作用會增強且毒性會降低。上述結果有助于烏頭屬生物堿的中毒和解毒的相關研究。

此外，AC在體外小鼠和豚鼠肝微粒體中的主要Ⅰ相代謝途徑相同，結合文獻報道，AC在大鼠肝微粒體中產(chǎn)生的主要CYP代謝產(chǎn)物與筆者的研究一致，O-脫甲基、N-脫乙基和脫氫反應為最主要的CYP代謝途徑[4]。在人的肝微粒體和尿液中也發(fā)現(xiàn)一致的代謝產(chǎn)物[8]，說明由于藥物代謝途徑的不同，產(chǎn)物對AC藥效或安全性的影響不同而導致的種屬差異的風險相對較小。

圖2 質譜圖A1.M5的MS圖；A2.M5[M+H]+(m/z 662)的MS2圖；B1.M6的MS圖；B2.M6[M+H]+(m/z 644)的MS2圖；C1.M7的MS圖；C2.M7[M+H]+(m/z 630)的MS2圖；D1.M8的MS圖；D2.M8[M+H]+(m/z 604)的MS2圖Fig 2 Mass chromatogramsA1.MS chromatograms of M5；B1.MS2[M+H]+(m/z 662)of M5；B1.MS chromatograms of M6；B2.MS2[M+H]+(m/z 644)of M6；C1.MS chromatograms of M7；C2.MS2[M+H]+(m/z 630)of M7；D1.MS chromatograms of M8；D2.MS2[M+H]+(m/z 604)of M8

圖3 AC在豚鼠和小鼠肝微粒體中可能的代謝途徑Fig 3 Proposed metabolic pathways of AC in liver microsomes of mice and guinea pig

[1]呂桂玲，張一民，宋興芳，等.653例含烏頭堿類藥物致不良反應文獻分析[J].中國藥房，2007，18（5）：374.

[2]Murayama M，Mori T，Bando H，et al.Studies on the constituents of Aconitum species.Ⅸ.The pharmacological properties of pyro-type aconitine alkaloids，components of processed aconite powder'kako-bushi-matsu'：analgesic，antiinflammatory and acute toxic activities[J].J Ethnopharmacol，1991，35（2）：159.

[3]Xiao K，Wang L，Liu Y，et al.Study of aconitine toxicity in rat embryos in vitro[J].Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol，2007，80（3）：208.

[4]Wang Y，Wang S，Liu Y，et al.Characterization of metabolites and cytochrome P450 isoforms involved in the microsomal metabolism of aconitine[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，844（2）：292.

[5]Tang L，Ye L，Lu C，et al.Involvement of CYP3A4/5 and CYP2D6 in the metabolism of aconitine using human liver microsomes and recombinant CYP450 enzymes[J].Toxicol Lett，2011，202（1）：47.

[6]Li R，Wu Z，Zhang F，et al.Differentiation of three pairs of aconite alkaloid isomers from aconitum nagarum var.lasiandrum by electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20（2）：157.

[7]孫 瑩，張宏桂，史向國，等.兔體內(nèi)烏頭堿代謝產(chǎn)物研究[J].藥學學報，2002，37（10）：781.

[8]Ameri A.The effects of aconitum alkaloids on the central nervous system[J].Prog Neurobiol，1998，56（2）：211.