復(fù)方腦康膠囊對(duì)β-淀粉樣肽誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究

胡文軍，鄧朝暉，李國(guó)鋒（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥劑科，廣州510515；.廣州軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，廣州 510500）

隨著社會(huì)的老齡化，老年人的健康保健問(wèn)題成為一個(gè)社會(huì)問(wèn)題。根據(jù)流行病學(xué)資料，我國(guó)老年癡呆的患病率越來(lái)越高，1990年為4.61%，2001年為7.2%。隨著年齡增長(zhǎng)患病率逐浙增高，80歲以上的老年人患病率大于20%[1]。我國(guó)現(xiàn)有老年人口1.4億，約有600萬(wàn)老年癡呆患者。老年性癡呆是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要病理特征，而老年斑以β-淀粉樣肽（β-peptide，Aβ）沉積為核心，可溶性Aβ對(duì)神經(jīng)元具有毒性作用，在體外可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[2]。本研究擬通過(guò)觀察復(fù)方腦康膠囊水提液對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，探討其藥理作用，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KSB-IA型超凈工作臺(tái)(天津塵埃凈化設(shè)備廠)；MCO-15Ac型CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司)；CKX31型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；LD5-10B型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；Σ960型酶標(biāo)儀（臺(tái)灣Metertech Inc公司）。

1.2 試藥

復(fù)方腦康膠囊（廣州軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，批號(hào)：091011），取膠囊內(nèi)容物用蒸餾水煮沸40 min，將上清液調(diào)整為0.5 g（生藥）/mL；作為復(fù)方腦康膠囊水提取液，備用；Aβ25-35、MTT、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定試劑盒（北京化工廠，批號(hào)：090825）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：090612）；青霉素、鏈霉素（上海奔大生物科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞株

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院提供。

2 方法[3，4]

2.1 SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)

DMEM培養(yǎng)基加體積分?jǐn)?shù)為0.15的胎牛血清、青霉素1×105u·L-1、慶大霉素8×104u·L-1，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞。待細(xì)胞增長(zhǎng)至70%融合時(shí)，用含EDTA-2Na（0.1 g·L-1）的0.5 g·L-1胰蛋白酶消化傳代，1∶4分瓶傳代，每3～4 d傳代1次。當(dāng)細(xì)胞用藥物（Aβ25-35、復(fù)方腦康膠囊）處理時(shí)，換用含體積分?jǐn)?shù)為0.02的胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2 d換液1次。

2.2 藥物試驗(yàn)濃度的確定

取復(fù)方腦康膠囊水提取液適量，加培養(yǎng)液使藥物濃度分別為 0.062 5、0.125、0.25、0.5、0.725、1.0、2.0、4.0 g·L-1。將SH-SY5Y細(xì)胞以每1 mL含2.5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔體積200 μL，72 h后加上述不同濃度含藥培養(yǎng)液，每組4孔。于接種后第4 天，每孔加MTT（5 g·L-1）20 μL ，37 ℃孵育4 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，振搖10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處吸光度（OD），細(xì)胞的存活率與其OD值呈正比。結(jié)果表明，最適濃度為0.725 g·L-1，因此選取0.725 g·L-1濃度用于以下試驗(yàn)。復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Effect of Compound naokang capsules aqueous extract with different concentrations on metabolic rate of SHSY5Y cells

2.3 LDH漏出率測(cè)定

將SH-SY5Y細(xì)胞以1×104個(gè)的密度接種于24孔板，每孔體積1 mL，72 h后分為對(duì)照、Aβ25-35（25 μmol·L-1）和復(fù)方腦康膠囊（0.725 g·L－1）+Aβ25-35（25 μmol·L-1）組，每組8孔。于接種后第4天留取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照LDH測(cè)定試劑盒所示方法，測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處的OD值，并以此值作為L(zhǎng)DH漏出率。

2.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

將SH-SY5Y細(xì)胞以每1 mL 2.5×103個(gè)的密度接種于96孔板，每孔體積200 μL，72 h后分為對(duì)照、Aβ25-35（25 μmol·L－1）和復(fù)方腦康膠囊（0.725 g·L－1）+Aβ25-35（25 μmol·L-1）組，每組8～12孔。于接種后第4天，每孔加MTT（5 g·L－1）20 μL，37 ℃孵育4 h ，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，振搖10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處OD值。

2.5 形態(tài)學(xué)觀察

將SH-SY5Y細(xì)胞接種于35 cm2小皿中，72 h后分為對(duì)照、Aβ25-35（25 μmol·L－1）和復(fù)方腦康膠囊 0.725 g·L－1+Aβ25-3525 μmol·L－1組。加藥后24 h ，瑞氏染色，每組隨機(jī)取70 個(gè)細(xì)胞，用HPIAS21000高清晰度彩色圖文報(bào)告管理系統(tǒng)及醫(yī)學(xué)影像計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞軸突長(zhǎng)度和胞體面積。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LDH漏出率測(cè)定結(jié)果

細(xì)胞受損時(shí)LDH釋放于培養(yǎng)上清液中，上清液LDH水平反映出細(xì)胞損傷或死亡程度，SH-SY5Y細(xì)胞損傷后培養(yǎng)液中的LDH明顯增加。Aβ25-35組LDH漏出率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明Aβ25-35可致SH-SY5Y細(xì)胞損傷；而復(fù)方腦康膠囊+Aβ25-35組顯著低于Aβ25-35組（P＜0.01），說(shuō)明復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用。復(fù)方腦康膠囊對(duì)SHSY5Y細(xì)胞LDH漏出率的影響見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞LDH漏出率的影響（±s）Tab 1 Effect of Compound naokang capsules on LDH leakage rate of SH-SY5Y cells（±s）

表1 復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞LDH漏出率的影響（±s）Tab 1 Effect of Compound naokang capsules on LDH leakage rate of SH-SY5Y cells（±s）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與Aβ25-35組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.Aβ25-35group：#P＜0.01

組別對(duì)照組Aβ25-35組復(fù)方腦康膠囊+Aβ25-35組LDH漏出率/%789.1±63.5 1 344.2±253.3＊675.7±89.5#

3.2 細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果

Aβ25-35組OD值顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），而復(fù)方腦康膠囊+Aβ25-35組的OD 值顯著高于Aβ25-35組（P＜0.01），表明Aβ25-35可顯著降低SH-SY5Y細(xì)胞的活性，而預(yù)先用復(fù)方腦康膠囊處理培養(yǎng)基，則可明顯減輕Aβ25-35對(duì)細(xì)胞造成的損傷。復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響見(jiàn)表2。

表2 復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響（±s）Tab 2 Effect of Compound naokang capsules on cytoactive of SH-SY5Y cells assayed（±s）

表2 復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響（±s）Tab 2 Effect of Compound naokang capsules on cytoactive of SH-SY5Y cells assayed（±s）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與Aβ25-35組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.Aβ25-35group：#P＜0.01

組別對(duì)照組Aβ25-35組復(fù)方腦康膠囊+Aβ25-35組OD值0.601±0.005 0.590±0.006＊0.622±0.004#

3.3 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

Aβ25-35組軸突長(zhǎng)度和胞體面積顯著小于對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明Aβ25-35可致SH-SY5Y細(xì)胞損傷；而復(fù)方腦康膠囊加Aβ25-35組軸突長(zhǎng)度和胞體面積顯著大于Aβ25-35組（P＜0.01），說(shuō)明復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響見(jiàn)表3。

表3 復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響（±s）Tab 3 Effect of Compound naokang capsules on morphology of SH-SY5Y cells（±s）

表3 復(fù)方腦康膠囊對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響（±s）Tab 3 Effect of Compound naokang capsules on morphology of SH-SY5Y cells（±s）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與Aβ25-35組比較：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.Aβ25-35group：#P＜0.01

組別對(duì)照組Aβ25-35組復(fù)方腦康膠囊+Aβ25-35組軸突長(zhǎng)度/mm 46.14±9.18 25.28±7.67＊55.31±7.33#胞體面積/μm2 642.42±91.27 487.02±72.41＊709.22±66.45#

4 討論

SH-SY5Y具有神經(jīng)元的形態(tài)特點(diǎn)，能在體外不斷傳代，較原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元容易培養(yǎng)，因而被廣泛用于神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域的研究。SH-SY5Y細(xì)胞利于Aβ在細(xì)胞外的培養(yǎng)基中聚合并形成纖維性結(jié)構(gòu)，同時(shí)將Aβ攝取入細(xì)胞內(nèi)造成細(xì)胞內(nèi)Aβ堆積在目前常用的細(xì)胞系中，并將Aβ攝取入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步處理。Aβ與SH-SY5Y細(xì)胞間的這種關(guān)系為其作為體外介質(zhì)研究Aβ的神經(jīng)細(xì)胞毒性提供了可能。已有的研究發(fā)現(xiàn)，包括Aβ25-35在內(nèi)的Aβ肽段均可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞出現(xiàn)與大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞變性相似的改變。因此，用β淀粉樣蛋白作用于SH-SY5Y細(xì)胞制備的老年癡呆模型，是研究老年癡呆較好的細(xì)胞模型之一。

本研究結(jié)果表明，復(fù)方腦康膠囊在體外能促進(jìn)細(xì)胞胞體和軸突的生長(zhǎng)，能促進(jìn)神經(jīng)元存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)元毒性。復(fù)方腦康膠囊的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用和神經(jīng)保護(hù)作用可能與促進(jìn)線粒體代謝和減少細(xì)胞損傷有關(guān)。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)精神病學(xué)分會(huì).中國(guó)老年期癡呆防治指南[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：15.

[2]蔡 貞，姬志娟，徐艷玲，等.APP17肽對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（1）：31.

[3]張景艷，孟 艷，趙志煒，等.救腦益智膠囊對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y生長(zhǎng)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，22（6）：82.

[4]余惠旻，周紅祖.基于細(xì)胞凋亡表達(dá)的中藥四性模式識(shí)別系統(tǒng)研究——西洋參和紅參抗MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的藥性學(xué)對(duì)比研究[J].中國(guó)藥房，2009，20（18）：1 367.