丁香酚在大鼠體內的組織分布研究

李婷婷，陳蓉，曾文婷，趙雪，張斌，楊書（.成都醫學院藥學院，成都60083；.成都市363醫院藥劑科，成都 60083；3.成都醫學院公共衛生系，成都 60083）

丁香酚（C10H12O2，4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，分子量為164.20），廣泛存在于丁香油、肉桂葉油、樟腦油等芳香油中，是丁香和丁香羅勒油的主要成分[1]。近年來對丁香酚的藥理作用和可能的相關機制研究都取得了一定進展。研究表明，丁香酚具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗過敏、麻醉[2～5]等廣泛的藥理活性。本課題組對丁香酚在大鼠體內的藥動學進行了研究，建立了其在大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺的高效液相色譜（HPLC）含量測定方法，觀察經單劑量給藥后在大鼠體內4個時間點和主要臟器中的分布經時變化。

1 儀器與材料

1.1 儀器

U-3000 HPLC儀，包括P680型高壓泵、ASI-100型自動進樣器、UVD170U型多波長紫外檢測器、真空脫氣機、自動進樣器（美國Agilent公司）；CP225D型電子天平（美國Sartorius公司）；TGL-16型臺式離心機（上海市安亭科學儀器廠）；XW-80A型渦旋混合儀（上海青浦滬西儀器廠）；移液器（20～200 μL，美國Hamilton公司）。

1.2 試藥

丁香酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：A0074）；肉桂酸標準品（國藥集團化學試劑有限公司，批號：A0305，純度≥98%）；甲醇（英國Dikma公司，批號：93102）；乙醇（成都市科倫化學試劑廠，批號：20090725）；冰醋酸、氫氧化鈉（天津市致遠化學試劑有限公司）；水為實驗室自制超純水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康SD大鼠24只，♂，體重（200±20）g，由四川大學實驗動物中心提供（動物使用合格證號：34動管122號）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Allsphere ODS-2 RP-18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.5%冰醋酸（63∶37，V/V，pH 3.80）；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：20 μL。

2.2 組織樣品預處理

取大鼠組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺），于生理鹽水中去除粘連組織，剪碎、稱重后按所取組織重量加入3倍體積的生理鹽水，于玻璃組織勻漿器中勻漿，精密量取大鼠組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺）勻漿液0.5 mL，置于4 mL離心管中，加入內標肉桂酸25 μL，渦旋混勻30 s，混勻后加入甲醇1 mL，繼續渦旋混勻3 min，12 000 r·min-1離心3 min，取上層清液，在“2.1”項下色譜條件下測定，記錄內標峰面積和丁香酚峰面積，代入標準曲線計算大鼠組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺）中丁香酚的濃度。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取丁香酚對照品適量，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容制備成濃度為68.672 μg·mL-1的貯備液，經稀釋，配制成濃度為 0.537、1.074 5、2.167、4.292、8.584、17.168、34.336 μg·mL-1的對照品溶液，于0～4 ℃貯藏，備用。

2.3.2 內標溶液的制備 精密稱取肉桂酸標準品適量，置于25 mL容量瓶中，制備成濃度為31.80 μg·mL-1的甲醇稀釋液，即得到內標溶液，于0～4℃貯藏，備用。

2.3.3 丁香酚給藥液的制備 精密稱取丁香酚對照品適量，加入70%乙醇-聚氧乙烯蓖麻油（1∶1）溶液充分溶解后稀釋，配制濃度為2.26 mg·mL-1的丁香酚給藥溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線的制備 精密量取大鼠組織樣品勻漿液（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺）0.5 mL，置于離心管中，依次加入不同濃度的丁香酚對照品溶液25 μL，渦旋混勻30 s，分別得濃度為 2.158、1.078、0.539、0.279、0.139、0.054、0.011 μg·mL-1含藥試樣，按“2.2”項下從“加入內標肉桂酸”開始操作。測定組織樣品勻漿中內標峰面積（Ais）和樣品丁香酚的峰面積（Aa）。以Aa與Ais的比值（A）為縱坐標，濃度c（μg·mL-1）為橫坐標，進行線性回歸，得大鼠各組織中標準曲線和相關系數，詳見表1。

表1 大鼠各組織中標準曲線和相關系數Tab 1 Standard curves and correlation coefficients of eugenol in each organ

2.4.2 專屬性試驗 取空白胃組織樣品加丁香酚和內標物肉桂酸，按“2.2”項下方法處理后照“2.1”項下色譜條件分別進樣測定。結果表明，各組織中的內源性物質對測定結果無影響，丁香酚的保留時間約為9.7 min，內標物肉桂酸的保留時間約為7.6 min，兩者峰形良好，基線平穩。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白胃樣品；B：空白胃樣品+丁香酚（0.279 μg·mL-1）+內標（0.135 μg·mL-1）；C.給藥后60 min的胃樣品+內標；1.內標；2.丁香酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank stomach homogenates；B.blank stomach homogenates+eugenol（0.279 μg·mL-1）+IS（0.135 μg·mL-1）；C.stomach homogenate 60 min after administration+IS；1.IS；2.eugenol

2.4.3 最低定量濃度的確定 配制一系列不同濃度的丁香酚溶液，按“2.2”項下方法測定樣品峰面積。結果表明，丁香酚組織勻漿液濃度在0.011～2.158 μg·mL-1范圍內，與峰面積比值呈良好線性關系，故確定丁香酚組織樣品勻漿液最低定量濃度為 0.011 μg·mL-1。

2.4.4 方法回收率試驗 取不同濃度丁香酚對照品溶液各25 μL，加入0.5 mL空白組織（心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺）勻漿液中，配制高、中、低濃度的含藥組織樣品勻漿液，按“2.2”項下從“加入內標肉桂酸”開始操作，以測得值與加入量的比值計算回收率。結果，回收率在（83.35±3.37）%～（105.21±5.49）%范圍之間，表明該法可用于測定大鼠組織中目標化合物的濃度。

2.4.5 精密度試驗 取丁香酚高、中、低濃度的組織樣品各6份，每一濃度進行6樣本分析，按“2.4.4”項下方法測定，以同日內5次測定結果計算日內精密度，以1周內3 d測定結果計算日間精密度。結果表明，本方法測定的丁香酚組織樣品的日內和日間精密度RSD均＜15%，符合規定。

2.4.6 絕對回收率試驗 取丁香酚高、中、低濃度的組織樣品各3份，按“2.2”項下方法操作，測得樣品中被測物的色譜峰面積，與相應濃度的對照品溶液中被測物的色譜峰面積比較，計算絕對回收率。結果，被測物和內標在高、中、低濃度組織樣品中絕對回收率均＞60%，表明組織樣品的萃取方法穩定可靠。

2.4.7 組織樣品穩定性試驗 取丁香酚組織樣品高、低濃度各3份，于（20±2）℃下保存10 h后測定，考察組織樣品的短期穩定性；取組織樣品高、低濃度各3份，制備12 h后測定，考察組織樣品的制備后穩定性；取組織樣品高、低濃度各3份，冷凍貯藏于－20℃，在室溫中充分解凍，然后再次冷凍，重復3個凍融周期后測定，考察組織樣品的3周期凍融穩定性。結果，RSD均＜15%，表明組織中的被測物穩定，其濃度可以被準確測定。

2.5 組織分布研究

2.5.1 組織樣品的處理與預處理 選取SD大鼠，隨機均分為4組，每組6只，ig丁香酚給藥液，0.25 mL/只。4組大鼠分別于給藥后40 min和2、4、6 h斷頸處死，取出心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、腦、前列腺，稱重，按各組織的重量加入3倍體積的生理鹽水，在玻璃組織勻漿器中分別制成各組織勻漿，所得勻漿液于－20℃貯藏，備用。

2.5.2 組織樣品分布研究 大鼠ig丁香酚后，考察其在心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腦、前列腺組織中不同時間點的分布經時變化。大鼠各組織中不同時間點藥物濃度見表2；ig丁香酚后大鼠各組織中待測化合物的平均藥物濃度分布曲線見圖2。

表2 大鼠各組織中不同時間點藥物濃度（μg·g-1，±s）Tab 2 The drug concentration of rat tissues at different time points（μg·g-1，±s）

表2 大鼠各組織中不同時間點藥物濃度（μg·g-1，±s）Tab 2 The drug concentration of rat tissues at different time points（μg·g-1，±s）

組織 時間點/min心肝脾肺腦腎胃前列腺大腸小腸40 1.990 1±0.072 4 4.792 1±0.154 8 9.973 1±0.312 7 8.920 7±0.413 5 3.232 8±0.117 2 5.536 5±0.183 0 3.790 8±0.099 8 1.200 8±0.058 0 9.591 3±0.428 0 7.381 7±0.207 4 120 2.677 2±0.088 5 9.040 3±0.276 2 12.181 1±0.479 0 11.331 2±0.591 0 3.588 7±0.168 4 10.113 4±0.295 6 9.124 5±0.331 0 1.487 3±0.074 5 13.680 3±0.446 0 13.403 5±0.370 0 240 1.404 1±0.046 5 2.833 0±0.095 7 4.736 9±0.122 6 4.431 7±0.211 2 2.039 8±0.087 5 2.609 5±0.088 4 2.392 9±0.058 0 0.973 1±0.040 4 5.440 8±0.154 7 3.041 2±0.100 9 360 0.823 1±0.033 7 0.516 1±0.019 7 1.061 8±0.032 6 0.932 9±0.041 8 0.467 5±0.018 0 0.575 0±0.016 5 0.915 2±0.025 0 0.332 9±0.017 8 0.690 6±0.014 2 1.422 4±0.057 4

3 討論

圖2 ig丁香酚后大鼠各組織中待測化合物的平均藥物濃度分布曲線圖（n＝6）Fig 2 Average concentration curves of measured compound in rat tissues after intragastical administration of eugenol（n＝6）

藥物體內分布是指藥物從全身循環轉運到各器官、組織的過程。藥物進入體循環后分布于全身各組織，由于器官之間的血液灌注存在差異，藥物與組織結合力不同等因素的影響，導致藥物分布一般是不均勻的。組織分布研究的重要性不亞于血漿藥物濃度研究，雖然對人體組織直接測量藥物的含量存在很大困難，現階段卻可以利用實驗動物獲得的數據借助數學模型推導出在人體內的分布參數，為藥物的有效性和毒副作用作出合理的解釋[6]。

本研究采用ig給藥的方式，初步研究丁香酚在大鼠體內心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、大腸、小腸、前列腺中的分布規律，完善丁香酚藥動學研究。雖然前列腺不是主要的藥物代謝器官，但選擇它是為丁香酚對前列腺增生的抑制作用的研究提供基礎依據。結果表明，給藥后丁香酚能較快分布到各組織中，分布范圍較廣，其中在腸、脾水平相對較高，腦中則較低。根據不同時間的采樣點所得樣品相互比較，可見120 min采樣點各組織中的丁香酚含量基本都高于其他幾個采樣點的含量，隨后，采樣時間越長，丁香酚含量呈逐漸降低的趨勢。總之，本試驗可為丁香酚的進一步研究提供理論依據。

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[6]陳 鋒，袁 媛，李澤有，等.黃酮類化合物組織分布研究進展[J].中國藥房，2007，18（30）：2 379.