淫羊藿提取物自乳化軟膠囊的制備工藝研究Δ

姚慧娟，姚慧敏，卜書紅，陸曉彤，張健#（.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥劑科，上海0009；.通化師范學(xué)院制藥與食品科學(xué)系，吉林通化 3400）

淫羊藿提取物為小檗科植物淫羊藿的提取物，其主要成分為淫羊藿苷等黃酮類化合物，具有促進雄性激素分泌、降血壓、擴張血管、增加冠脈流量、增強免疫功能和抗腫瘤等多種藥理作用[1]。但黃酮類化合物難溶于水，生物利用度低[2]。為解決這一問題，筆者研制了淫羊藿提取物自乳化軟膠囊[3]，由淫羊藿提取物、油相、非離子表面活性劑和助乳化劑組成，在環(huán)境溫度和輕微攪動下，形成自乳化藥物溶液，藥物活性成分被包裹于這些細小的油滴中，能快速分布于胃腸道，可提高淫羊藿活性成分的溶出度。

1 儀器與試藥

1100高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）；Nicomp-380/ZLS粒度測定儀（美國PSS公司）；ZRS24智能溶出試驗儀（天津大學(xué)無線電廠）。

淫羊藿提取物（淫羊藿苷含量：60.47 mg·g－1）、淫羊藿提取物軟膠囊（以下簡稱普通軟膠囊，批號：101011、101012、101011，規(guī)格：0.5 g/粒）、淫羊藿提取物自乳化軟膠囊（批號：101001、101002、101001，規(guī)格：0.5 g/粒）均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥劑科自制；淫羊藿苷標準品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：10051121，純度：99.1%）；吐溫80（北京益利精細化學(xué)品有限公司，批號：101201）；油酸乙酯（北京長城化學(xué)試劑廠，批號：101106）；聚乙二醇-8-甘油辛酸/葵酸酯（Labrasol）、乙二醇單乙基醚（Transcutol）（法國Gattefosse公司，批號分別為：100501、100302）；丙二醇、聚乙二醇（PEG）400（北京精求化工有限公司，批號分別為100911、100708）；大豆油（山東魯花集團有限公司，批號：20100308）；甲醇、乙腈均為色譜級，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 自乳化軟膠囊的制備

稱取淫羊藿提取物適量，按照處方量加入油相、乳化劑和助乳化劑至具塞容器中，40℃恒溫超聲（功率：500 W，頻率：50 kHz）處理30 min，機械攪拌10 min，使其充分溶解，離心（4 000 r·min－1）5 min，棄去沉淀，所得自乳化藥液與明膠經(jīng)自動旋轉(zhuǎn)軋囊機（溫度：25℃，相對濕度：45%）壓制成軟膠囊（0.5 g/粒），即得。

2.2 淫羊藿苷的含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Ecilpse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（26∶74）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2 標準品溶液的制備 取淫羊藿苷標準品適量，精密稱定，加無水乙醇溶解，制成每1 mL中含0.248 mg的溶液，作為標準品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品20粒的內(nèi)容物，混勻，精密稱定0.5 g，置25 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，超聲處理（功率：500 W，頻率：50 kHz）30 min，濾過，精密吸取續(xù)濾液1.0 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，即得。

2.2.4 專屬性試驗 分別精密吸取標準品溶液、供試品溶液和空白輔料溶液20 μL，注入液相色譜儀中，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液在與標準品溶液相同位置處有吸收峰，而空白輔料無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.標準品；B.供試品；C.空白輔料；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.standard substance；B.test sample；C.blank excipients；1.icraiin

2.2.5 標準曲線的制備 精密吸取標準品溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL，置于10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，分別制成系列濃度溶液，搖勻。精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定。以淫羊藿苷峰面積積分值（A）為縱坐標，淫羊藿苷檢測濃度（c）為橫坐標，制備標準曲線，得回歸方程為A＝35.336c－9.773 8（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，淫羊藿苷檢測濃度在4.96～49.60 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取標準品溶液適量，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定，于同日和隔日連續(xù)進樣6次。結(jié)果，日間RSD＝0.25%（n＝6），日內(nèi)RSD＝0.36%（n＝6），表明儀器的日內(nèi)、日間精密度均良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密吸取已知淫羊藿苷含量（含量：12.08 mg·g－1）的淫羊藿提取物自乳化軟膠囊樣品0.125 g，共6份，分別精密加入1.57 mg的淫羊藿苷標準品，按“2.2.1”項下色譜條件測定，分別進樣3次，計算加樣回收率。結(jié)果，淫羊藿苷的平均回收率為99.8%，RSD＝0.38%（n＝6）。

2.3 溶解度試驗

精密量取表1中各輔料2 mL，分別加入過量的淫羊藿提取物細粉，置10 mL具塞刻度試管中，密封，渦旋震蕩混勻，于40℃、150 r·min－1恒溫水浴搖床中機械振蕩使其充分溶解，于不同時間點精密吸取溶液適量，離心（4 000 r·min－1）5 min，取上清液或下清液用無水乙醇稀釋，定容至50 mL，作為供試品溶液。注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定，用外標一點法計算各輔料中淫羊藿苷的含量。如此反復(fù)直至淫羊藿苷濃度不變，同法重復(fù)操作2次，取其平均值，即得淫羊藿苷的飽和溶解度。淫羊藿苷在不同輔料中的飽和溶解度見表2。

表1 淫羊藿苷在不同輔料中的飽和溶解度Tab 1 Solubility of icariin in various excipients

由表1可知，淫羊藿苷在油相中溶解度較好的為油酸乙酯，在乳化劑中溶解度較好的為吐溫80，在助乳化劑中溶解度較好的為Transcutol。故選擇油酸乙酯、吐溫80、Transcutol分別為淫羊藿提取物自乳化軟膠囊的油相、乳化劑和助乳化劑，進行配伍篩選試驗。

2.4 處方篩選

自乳化制劑處方中，油相比例一般為25%～70%，乳化劑比例為25%以上，助乳化劑比例為0%～25%[4]。參照上述比例范圍，精密稱取定量的淫羊藿提取物細粉，分別加入不同比例的油相、乳化劑和助乳化劑，按“2.1”項下方法制備自乳化藥液，取此乳化藥液0.1 g，加入到200 mL 37℃的濃度為0.1 mol·L－1HCl溶液中，用磁力攪拌器以50 r·min－1的速度溫和攪拌，以自乳化時間、色澤、澄清度為指標，判斷是否形成自乳化給藥系統(tǒng)（即自乳化時間在2 min之內(nèi)，能形成具有乳光的澄清透明自乳化溶液）。繪制偽三元相圖，以選定的油相、乳化劑和助乳化劑各為一角，將能形成乳液的處方確定為相圖中可自乳化的點，繪制自乳化效果較好的區(qū)域，詳見圖2。

圖2 淫羊藿提取物自乳化偽三元相圖Fig 2 Pseudo ternary phase diagram of Epinmedii Folium extract self-emulsifying soft capsule

由圖2可知，淫羊藿提取物自乳化區(qū)域中油酸乙酯含量（含藥）在25%～45%，吐溫80在40%～75%，Transcutol在0%～30%范圍內(nèi)，自乳化效果較好。考慮到用藥的安全性和軟膠囊的劑型特點，在保證制劑穩(wěn)定的前提下，盡量降低乳化劑和助乳化劑用量，故確定淫羊藿提取物自乳化軟膠囊的最優(yōu)處方為淫羊藿提取物∶油酸乙酯∶吐溫80∶Transcutol＝10∶33.75 ∶45∶11.25。

2.5 處方評價

2.5.1 穩(wěn)定性試驗 按最優(yōu)處方制備淫羊藿提取物自乳化軟膠囊，分別置于4℃冷藏柜中、室溫（25℃）和冷（4℃）、熱（37℃）4種溫度條件下交替循環(huán)，12 h改變1次，進行穩(wěn)定性考察。結(jié)果，20 d后溶液仍保持均一、透明，無沉淀析出，未出現(xiàn)分層現(xiàn)象。

2.5.2 體外溶出度試驗 照溶出度測定法[5]，以900 mL 0.1 mol·L－1HCl溶液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為 100 r·min－1，溫度為37℃，將6個大小、形狀相同，內(nèi)含2 mL溶出介質(zhì)的透析袋完全浸入溶出介質(zhì)中，平衡12 h。取淫羊藿提取物自乳化軟膠囊和普通軟膠囊各6粒，放于轉(zhuǎn)籃中，分別于10、30、60、90、120 min各取出一個透析袋，倒出袋內(nèi)溶液，以微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取適量續(xù)濾液，按“2.2”項下方法測定袋內(nèi)介質(zhì)中淫羊藿苷的濃度。其中一透析袋在溶出介質(zhì)中保留12 h后測定，作為藥物從乳劑中完全釋放后介質(zhì)中藥物的總濃度。根據(jù)各時間點淫羊藿苷的含量繪制2種制劑的溶出曲線。結(jié)果，淫羊藿提取物自乳化軟膠囊的溶出度明顯高于普通軟膠囊。2種制劑中淫羊藿苷的溶出曲線見圖3。

圖3 2種制劑中淫羊藿苷的溶出曲線Fig 3 Dissolution curves of icriin in 2 preparation

2.5.3 粒徑的測定 將最佳處方的自乳化藥液用0.1 mol·L－1HCl溶液稀釋2 000倍，放入樣品池內(nèi)，將光強度調(diào)節(jié)至300左右，光源為HeNe激光（λ0＝633 nm），介質(zhì)為0.1 mol·L－1HCl溶液（n＝1.33），溫度為20℃，維持20 min，測定粒徑。結(jié)果，平均粒徑為275.1 nm，粒徑較小且分布較窄，呈單峰。粒徑測定結(jié)果見圖4。

圖4 粒徑測定結(jié)果Fig 4 Results of determination of particle size distribution

3 討論

2010年版《中國藥典》中淫羊藿藥材中淫羊藿苷含量測定采用的稀釋溶劑為稀乙醇[6]。本試驗曾考察稀乙醇、50%乙醇、70%乙醇作為溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含水溶劑會干擾自乳化制劑，造成制劑溶液呈現(xiàn)乳化狀態(tài)，可能會損壞色譜柱，降低其使用壽命。選用無水乙醇作為溶劑，則可排除表面活性劑的干擾，而且淫羊藿苷等總黃酮類成分在無水乙醇中的溶解度較大，回收率較高，符合含量測定的要求。

自乳化制劑中油相的比例一般占處方的25%～70%，要求能以較少的用量溶解處方量的藥物，并在低溫貯藏條件下也不會有藥物析出，同時遇水后容易被處方中的乳化劑乳化[4]。最早使用的油是天然植物油，但這些油溶解脂溶性藥物的能力有限，自乳化性能不強。中長鏈脂肪酸甘油酯具有良好的流動性、溶解性能和自乳化性能，常在自乳化系統(tǒng)中被優(yōu)先使用，故本文選用油酸乙酯作為油相。

目前，自乳化制劑還未得到充分的利用[7]，主要是由于其使用了大量的表面活性劑，長期服用可能對機體產(chǎn)生毒性[8]。自乳化制劑的處方篩選和質(zhì)量控制是設(shè)計優(yōu)良自乳化制劑的首要因素。因此，本試驗在處方篩選時，首選毒性低的表面活性劑作為乳化劑和助乳化劑，認真考慮表面活性劑的用量，嚴格將其控制在人的安全劑量范圍內(nèi)，通過繪制偽三元相圖來確定最優(yōu)處方。

藥物的釋放行為是微粒給藥系統(tǒng)的一項重要評價指標。通過查閱文獻及試驗對比，本文選用總體液平衡反向透析法來研究淫羊藿提取物自乳化軟膠囊的釋藥過程，此法不僅方便、快捷，而且能準確模擬自乳化制劑的釋藥行為。用此方法測出制得的淫羊藿提取物自乳化軟膠囊在相同條件下溶出度較普通軟膠囊高，表明自乳化釋藥系統(tǒng)能有效提高淫羊藿苷等黃酮類水難溶性成分的溶出速度和溶出量。

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[2]Chen Y，Zhao YH，Jia XB，et al.Intestinal absorption mechanisms of prenylated flavonoids present in the heat-processedEpimedium koreanumNakai（Yinyanghuo）[J].Pharm Res，2008，25（9）：2 190.

[3]楊 蕊，蘇樂群，黃 欣，等.齊墩果酸自微乳化給藥系統(tǒng)的制備及其體外溶出度考察[J].中國藥房，2010，21（33）：3 128.

[4]Yoo JH，Shanmugam S，Thapa P，et al.Novel self-nanoemulsifying drug delivery system for enhanced solubility and dissolution of lutein[J].Arch Pharm Res，2010，33（3）：417.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄85.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：207.

[7]張 娜，康虞玲，劉智勤，等.自微乳化藥物傳遞系統(tǒng)的應(yīng)用與進展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（11）：960.

[8]Singh B，Bandopadhyay S，Kapil R，et al.Self-emulsifying drug delivery systems（SEDDS）：formulation development，characterization，and applications[J].Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，2009，26（5）：427.