有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠脂肪組織perilipin A基因表達(dá)的影響

傅 姍，封飛虎，楊月琴

（1.溫州醫(yī)學(xué)院 體育科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州325035；2.武漢體育學(xué)院，湖北 武漢430079）

肥胖是由于長期的脂肪組織中三酰甘油的儲(chǔ)存與動(dòng)員之間的不平衡所［1］。雖然脂肪水解的基本規(guī)律并未被洞悉，但多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證明，脂肪細(xì)胞中的特殊蛋白perilipin在脂解過程中的起了重要作用。Perilipin是一種緊密結(jié)合在成熟脂肪細(xì)胞脂滴表面的蛋白，中文譯名為:脂滴包被蛋白、圍脂滴蛋白、脂被蛋白或周脂素。大鼠的perilipin基因生成多個(gè)mRNA片段，編碼生成至少四種亞型。盡管B亞型也在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，但A亞型是含量最大的。C亞型及D亞型只在甾體細(xì)胞中表達(dá)［2］。近年來關(guān)于脂滴包被蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，脂滴包被蛋白的表達(dá)與其調(diào)控脂解機(jī)制及其影響因素，以及脂滴包被蛋白與肥胖以及相關(guān)疾病關(guān)系的研究成為熱點(diǎn)。許多運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究者也開始關(guān)注脂滴包被蛋白的研究，但國內(nèi)外文獻(xiàn)相對(duì)較少。本研究擬通過對(duì)高脂膳食肥胖大鼠進(jìn)行長期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)，探討運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)脂肪組織perilipin A mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

健康清潔級(jí)3～4周齡離乳SD雄性大鼠60只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，體重60～95克。普通飼料由湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院提供。高脂飼料配方如下:50%標(biāo)準(zhǔn)飼料、15%豬油、10%白糖、5%奶粉、10%蛋黃、5%花生仁、5%芝麻油。

1.2 方法

1.2.1 肥胖與肥胖抵抗大鼠模型建立。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為2組，普通飼料喂養(yǎng)對(duì)照組（C）10只，高脂飼料誘導(dǎo)組50只，給予高脂飼料，自由進(jìn)食、進(jìn)水。大鼠肥胖判斷標(biāo)準(zhǔn):大鼠的體重超過普通飼料喂養(yǎng)大鼠平均體重的1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差即可作為實(shí)驗(yàn)肥胖大鼠［3］。經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠7周后，根據(jù)體重增加量，排名前16只大鼠擬定為肥胖大鼠。

1.2.2 肥胖與肥胖抵抗大鼠分組及干預(yù)。經(jīng)過篩選出的肥胖大鼠隨機(jī)分為兩組（每組8只）:肥胖不運(yùn)動(dòng)組（Ob）和肥胖運(yùn)動(dòng)組（Ob－E），第8周開始進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)與喂養(yǎng)普通飼料，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

有氧運(yùn)動(dòng)方案:大鼠專用電動(dòng)跑臺(tái)，坡度5°，速度15.2 m/min，相當(dāng)于64±4.5%VO2max強(qiáng)度［4］，并電擊驅(qū)趕。運(yùn)動(dòng)時(shí)間60min，每周6次，周日休息，持續(xù)八周。

1.3 標(biāo)本采集和保存

禁食12h后，將大鼠用戊巴比妥那腹腔麻醉，心臟取血后，分離血清，迅速取出腎周脂肪組織和睪周脂肪組織并稱重，用鋁箔紙包好，投入液氮中速凍，之后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。

1.4 測定方法

1.4.1 血清生化指標(biāo)的測定?？偰懝檀迹═C）、甘油三酯（TG）、高密度脂肪蛋白 （HDL－C）、低密度脂蛋白 （LDLC）由全自動(dòng)生化分析儀測定，按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.2 大鼠腹內(nèi)脂肪組織perilipin A mRNA表達(dá)的測定。

1.4.2.1 主要試劑與儀器。Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自日本TOYOBO公司。PCR儀（Life express Thermal Cycle）為杭州博日科技有限公司生產(chǎn)，熒光定量PCR儀（SLAN熒光定量PCR檢測系統(tǒng)）為上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)。

1.4.2.2 引物:由Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中國公司合成，perilipin A上游引物:5′－GGAGACAGATGAGGAGGAAG－3′，下游引物:5′－GCTGGTGTGAGGTGTAGGAT－3′（NM＿013094），產(chǎn)物207bp；β－actin上游引物:5’－CGTTGACATCCGTAAAGACCTC－3’，下游引物:5′ － TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT － 3′ （NM031144），產(chǎn)物110bp。

1.4.2.3 PCR擴(kuò)增。95℃預(yù)變性1min，95℃變性15s→58℃退火20s→72℃延伸20s，40次循環(huán)；72℃末段延伸5min；溶解曲線:72℃→95℃，每20s升溫1℃。

1.4.2.4 結(jié)果處理。采用比較閾值法表示目的基因的相對(duì)表達(dá)，即ΔΔCt法:目的基因的相對(duì)表達(dá)量＝2－△△Ct

2－△△Ct表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析使用13.0版SPSS統(tǒng)計(jì)軟件完成。結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示為顯著性差異，P＜0.01表示為非常顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠的體重、腹內(nèi)脂肪、脂體比及血脂水平的影響

結(jié)果顯示（見表1），與對(duì)照組（C組）相比，肥胖不運(yùn)動(dòng)組（Ob組）大鼠體重顯著升高（392.88±21.86vs 462.00±31.90，P＜0.05）；腹內(nèi)脂肪總量顯著明顯升高（9.56±0.70 vs 6.33±0.74，P＜0.01）；脂體比顯著升高（2.05±0.23vs 1.61±0.13，P＜0.05）；血清 TG顯著升高（0.49±0.10vs 0.38±0.09，P＜0.05）。

8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，與Ob組相比，肥胖運(yùn)動(dòng)組（Ob－E組）大鼠腹內(nèi)脂肪總量相比顯著降低（7.44±1.06vs 9.56±0.70，P＜0.05）；脂體比相比顯著降低（1.66±0.17vs 2.05±0.23，P＜0.05）。血清TG相比 Ob組顯著降低（0.41±0.05vs 0.49±0.10，P＜0.05）；Ob－E組血清 HDL－c顯著高于C組（1.03±0.17vs 0.88±0.13，P＜0.05）。

表1 各組大鼠檢測指標(biāo)比較表

2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠的脂肪組織perilipin A mRNA表達(dá)水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（見圖1，圖2），肥胖不運(yùn)動(dòng)組（Ob組）大鼠腹內(nèi)脂肪組織perilipin A mRNA表達(dá)量是C組的1.96倍（1.96±0.89，P＜0.05）；肥胖運(yùn)動(dòng)組（Ob－E組）大鼠腹內(nèi)脂肪組織perilipin A mRNA表達(dá)相比Ob組顯著降低（1.11±0.79vs 1.96±0.89，P＜0.05）見圖1。

圖1 大鼠腹內(nèi)脂肪組織perilipin A mRNA表達(dá)示意圖

圖2 perilipin A擴(kuò)增曲線示意圖（1號(hào)樣本）

3 分析討論

3.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖大鼠的體重、腹內(nèi)脂肪、脂體比及血脂水平的影響分析

機(jī)體脂肪細(xì)胞過度積累、肥大，造成機(jī)體脂肪含量不斷增加，形成肥胖，最終會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的健康水平下降和生理機(jī)能的紊亂。肥胖與糖尿病、高血壓、血脂異常、動(dòng)脈硬化等多種疾病高度相關(guān)［5］。肥胖是由于過多的熱能攝入與身體活動(dòng)減少之間的不平衡造成的，田吉明等［6］對(duì)SD雄性大鼠進(jìn)行10周高脂飲食可以引起大部分大鼠體重增加、脂肪重量和內(nèi)臟重量增加，形成高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠。李世成等［7］對(duì)SD雄性幼鼠進(jìn)行3周的高脂飼料喂飼，部分大鼠即達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)。本研究測得肥胖大鼠，相較于普通飲食大鼠，肥胖不運(yùn)動(dòng)組（Ob組）大鼠體重、腹內(nèi)脂肪總量、脂體比顯著升高，提示通過高脂飲食的飼喂，Ob組大鼠有明顯的內(nèi)臟肥胖。

長期低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)能夠降低血清TC（總膽固醇）、TG（甘油三酯），使 HDL－c（高密度脂蛋白）升高，LDL－c（低密度脂蛋白）降低［8］。何玉秀等［9］研究發(fā)現(xiàn)9周有氧游泳運(yùn)動(dòng)后，雄性大鼠體重增加量減少，腹部脂肪墊（腎周脂肪墊和附睪脂肪墊）的脂肪積累減少。本研究通過8周的有氧運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案干預(yù)，測得大鼠Ob－E組大鼠腹內(nèi)脂肪總量、脂體比、血清TG相比Ob組顯著降低，HDL－c顯著升高，說明8周有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)改善內(nèi)臟肥胖提高體質(zhì)量、改善血脂水平有顯著效果。

3.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食肥胖大鼠脂肪組織perilipin基因表達(dá)的影響分析

Perilipin是特異表達(dá)于脂肪細(xì)胞和類固醇生成細(xì)胞脂滴表面的一種磷蛋白，作為一種“分子開關(guān)”，它可以直接參與脂質(zhì)代謝的分子調(diào)控，胰島素、兒茶酚胺、腎上腺素等可通過引起perilipin磷酸化而啟動(dòng)脂肪分解［10］。在脂質(zhì)分解代謝中有雙重調(diào)節(jié)作［11］:①在基礎(chǔ)狀態(tài)下，它被認(rèn)為是脂質(zhì)分解的限速酶即激素敏感性脂肪酶（HSL）通道的屏障，從而保護(hù)甘油三酯（TG）免遭分解；②在刺激狀態(tài)下（如腎上腺素受體傲動(dòng)劑誘導(dǎo)的脂解作用），Perilipin被cAMP依賴的蛋白激酶A磷酸化，使HSL移位，從而促進(jìn)甘油三酯分解。

研究表明perilipin與肥胖癥、2型糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化均密切相關(guān)。田吉明等［6］實(shí)驗(yàn)證明飲食導(dǎo)致大鼠肥胖與其脂肪組織HSL活性和蛋白表達(dá)下調(diào)以及perilipin蛋白表達(dá)上調(diào)，因而認(rèn)為perilipin蛋白表達(dá)與促進(jìn)脂肪儲(chǔ)存有關(guān)。Tansey J T［12］等研究發(fā)現(xiàn)perilipin基因敲除小鼠出現(xiàn)了機(jī)體氧化、能量利用增加，而脂質(zhì)合成減少，能夠抵抗因高脂飲食所導(dǎo)致的肥胖。黃大祥［13］實(shí)驗(yàn)表明perilipm A mRNA在肥胖癥和2型糖尿病患者皮下和網(wǎng)膜脂肪組織表達(dá)較正常人高。有研究數(shù)據(jù)表明，perilipin A基因具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，perilipin A基因敲除小鼠在沒有血壓及血脂水平升高的情況下，出現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣硬化幾率升高的現(xiàn)象［14］。本研究實(shí)驗(yàn)中Ob組大鼠腹內(nèi)脂肪組織perilipin A mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組，也驗(yàn)證肥胖大鼠脂肪組織中perilipin A的基因表達(dá)上升。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)perilipin基因表達(dá)的影響的研究報(bào)道較少，并且報(bào)道結(jié)果不盡一致。田吉明［15］采用電動(dòng)動(dòng)物跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)一次急性運(yùn)動(dòng)可改善肥胖大鼠運(yùn)動(dòng)后血糖、血脂，這種改變可能與其脂肪組織 HS L基因表達(dá)上調(diào)以及腹部脂肪組織perilipin基因表達(dá)基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。Petridou A等［16］研究報(bào)道經(jīng)過8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組大鼠與未訓(xùn)練的大鼠相比，在肝臟有較低的脂肪酸合成酶，在附睪脂肪中有較高的脂肪酸合成酶、HSL和perilipin，在皮下脂肪有較高的HSL。兩組大鼠的肝臟、肌肉或脂肪中PPAR濃度沒有顯著變化。本研究發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行8周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案干預(yù)后，Ob－E組大鼠腹內(nèi)脂肪組織perilipin A mRNA表達(dá)相比Ob組顯著降低。但也有與此不同研究結(jié)果，Chapados N等［17］關(guān)于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)內(nèi)臟脂肪和非內(nèi)臟脂肪離體脂解的影響以及它們與周脂索濃度的關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，兩組雌性大鼠均以高脂飼料喂養(yǎng)8周，一組無運(yùn)動(dòng)，另一組運(yùn)動(dòng)8周，而結(jié)果顯示濃度沒有受到運(yùn)動(dòng)的影響。因此，運(yùn)動(dòng)對(duì)perilipin A的影響還有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。

4 結(jié) 論

通過本實(shí)驗(yàn)研究可知，高脂飲食致使大鼠腹部脂肪增加，血脂升高，腹部脂肪組織perilipin基因表達(dá)升高，而長期有氧運(yùn)動(dòng)可改善高脂飲食所致的肥胖大鼠的腹部脂肪減少，血脂水平改善，并且降低了腹部脂肪組織perilipin A基因表達(dá)。

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