香菇多糖及有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)訓(xùn)練大鼠免疫系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)研究

陳美琴，華 曄

（1.江蘇科技大學(xué) 體育學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212003；2.江蘇大學(xué) 附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江212001）

大強(qiáng)度急性運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖分化能力及活性降低，免疫球蛋白含量及功能也受到影響，運(yùn)動(dòng)員和健身者對(duì)疾病的易感率升高，影響他們的身體健康或比賽成績(jī)。所以預(yù)防大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后的免疫抑制成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的重要研究課題，同時(shí)尋找安全、有效、防治運(yùn)動(dòng)疲勞的運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或方法也是競(jìng)技體育和全民健身的迫切需要［1］。香菇作為一種常見的食藥兩用真菌，也是我國特產(chǎn)之一，在中醫(yī)藥中早有應(yīng)用，其活性成分香菇多糖是免疫調(diào)節(jié)劑，它的抗惡性腫瘤、抗病毒、抗感染、抗輻射、抗糖尿病等多方面藥理學(xué)作用已得到廣泛證實(shí)應(yīng)用［2，3］，但香菇多糖在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)方面的研究國內(nèi)外少見報(bào)道。有氧運(yùn)動(dòng)或適中負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)能提高機(jī)體的免疫機(jī)能，預(yù)防感染性疾病的發(fā)生［4，5］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)一次力竭運(yùn)動(dòng)大鼠力竭時(shí)間及力竭后大鼠脾、胸腺SOD，CAT，GSH－Px，MDA等抗氧化指標(biāo)、外周血CD4＋和CD8＋百分率的影響，以探求有效的減輕力竭訓(xùn)練引起的免疫器官脂質(zhì)過氧化損傷，改善運(yùn)動(dòng)疲勞，防治運(yùn)動(dòng)性免疫功能低下的調(diào)理措施。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法及動(dòng)物試劑儀器

本實(shí)驗(yàn)使用SD雄性大鼠，經(jīng)過4周的香菇多糖灌藥和有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，記錄力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，測(cè)試大鼠力竭后脾臟總超氧化物歧化酶（T－SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）、過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（T－AOC）用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)大鼠外周血T細(xì)胞亞群情況，并與對(duì)照組比較上述測(cè)量結(jié)果的變化。

本實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物、試劑、儀器主要包括SD雄性大鼠50只，8周齡，體重（200±20）g，由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂食，自由飲食，分籠飼養(yǎng)，動(dòng)物室溫20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，照明時(shí)間隨自然變化。依多靈香菇菌多糖片，購于福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司，化學(xué)成分為甘露聚糖肽，多糖部分以甘露糖為主，含少量的葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖，肽鏈?zhǔn)怯商扉T冬氨酸、組氨酸、賴氨酸、谷氨酸等18種氨基酸組成。SOD，CAT，GSH－Px，MDA，AOC，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量等試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。流式細(xì)胞儀為江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，正常使用中。

1.2 動(dòng)物分組

將50只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后隨機(jī)分為5組，每組10只，對(duì)照組（無運(yùn)動(dòng)，安靜狀態(tài)下取材）、一次力竭組（一次力竭運(yùn)動(dòng)后立即取材）、服藥＋力竭組（服藥4周后，進(jìn)行一次力竭運(yùn)動(dòng)，然后取材）、有氧＋力竭組（有氧運(yùn)動(dòng)4周后，進(jìn)行一次力竭運(yùn)動(dòng)，然后取材）、服藥＋有氧＋力竭組（有氧運(yùn)動(dòng)并服藥4周后，進(jìn)行一次力竭運(yùn)動(dòng)，然后取材）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物給藥方法

依據(jù)成人每日攝取香菇多糖0.666mg/kg日劑量（此值為每千克體重所需服用的多糖含量，香菇多糖片中多糖含量為2.5mg/片，不含賦形劑），將香菇多糖配制成一定濃度溶液，該濃度可保證每只大鼠0.2mL/d劑量，是成人劑量的4～5倍［6］。服藥組在每日訓(xùn)練后1h灌胃，共4周，給藥期間每三天稱一次體重，并根據(jù)體重變化及時(shí)調(diào)整給藥量。非服藥各組灌胃等量的生理鹽水。

1.4 運(yùn)動(dòng)方式

有氧運(yùn)動(dòng):采用Bedford據(jù)鼠體重/攝氧量回歸方程所建立的漸增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)模型［7］中的第1級(jí)負(fù)荷:0°，8.2m·min－1，15min（相當(dāng)于53%VO2max）。持續(xù)4周。一次力竭運(yùn)動(dòng):采用Bedford據(jù)鼠體重/攝氧量回歸方程所建立的漸增負(fù)荷運(yùn)動(dòng) 模 型［7］。第 1 級(jí)負(fù) 荷:0°，8.2m·min－1，15min（相當(dāng)于53%VO2max）；第2級(jí)負(fù)荷:5°，15m·min－1，15min（相當(dāng)于64%VO2max）；第3級(jí)負(fù)荷:10°，19.3m·min－1（相當(dāng)于76%VO2max）運(yùn)動(dòng)至力竭。運(yùn)動(dòng)中使用電刺激維持運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。力竭標(biāo)準(zhǔn):第3級(jí)負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，大鼠未能堅(jiān)持本級(jí)負(fù)荷運(yùn)動(dòng)跑速，先后滯跑道后1/3處達(dá)3次以上，刺激驅(qū)趕無效。行為特征為:呼吸急深、幅度大，腹臥位，垂頭，刺激后無反應(yīng)［8］。

1.5 樣品制備

對(duì)照組于安靜狀態(tài)下稱重后取材，其余各組予末次訓(xùn)練，記錄運(yùn)動(dòng)組開始訓(xùn)練至力竭的時(shí)間，并于力竭后稱重取材。取材方法為用適量乙醚麻醉大鼠后，迅速取脾臟置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，用濾紙吸干，稱重記錄，制備10%的勻漿，0℃～4℃，3500rpm離心15min，取上清液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 測(cè)試指標(biāo)及方法

總超氧化物歧化酶（T－SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）、過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（T－AOC）、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量等測(cè)定均嚴(yán)格按試劑盒說明程序進(jìn)行；T淋巴細(xì)胞亞群各項(xiàng)指標(biāo)由江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室協(xié)助測(cè)試。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)處理，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)（數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示）、相關(guān)分析和方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠力竭時(shí)間的變化

大鼠力竭時(shí)間有氧＋力竭組（104.52±3.58）min、服藥＋力竭組（103.67±4.12）min 和服藥＋有氧＋力竭組（112.16±7.46）min較一次力竭組（93.34±5.65）min長(zhǎng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有氧＋力竭組與服藥＋力竭組大鼠的力竭時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。服藥＋有氧＋力竭組大鼠的力竭時(shí)間較有氧＋力竭組、服藥＋力竭組大鼠長(zhǎng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠臟器指數(shù)的變化

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠脾臟指數(shù)的變化mg/g

表1顯示，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使大鼠脾臟指數(shù)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，灌服香菇多糖及有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠臟器指數(shù)高于一次力竭組，同時(shí)灌服香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)時(shí)此趨勢(shì)更明顯，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠脾組織部分抗氧化指標(biāo)的變化

由表2可知，一次力竭運(yùn)動(dòng)使大鼠脾組織抗氧化酶活性降低，其中T－AOC顯著降低（P＜0.05），T－SOD非常顯著降低（P＜0.01），脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA非常顯著升高（P＜0.01）。服藥＋力竭組與有氧＋力竭組大鼠脾組織抗氧化指標(biāo)無顯著性差異（P＞0.05）。灌服香菇多糖或有氧運(yùn)動(dòng)均可改善力竭大鼠抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)，其中CAT及MDA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而CAT在服藥＋力竭組和有氧＋力竭組與對(duì)照組比較時(shí)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)灌服香菇多糖和進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)可改善力竭大鼠抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)，其中，T－SOD、CAT顯著升高（P＜0.05），脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 MDA非常顯著降低（P＜0.01）；且CAT及T－AOC在服藥＋有氧＋力竭組與服藥＋力竭組和有氧＋力竭組比較時(shí)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠脾組織抗氧化系統(tǒng)部分指標(biāo)變化

2.4 實(shí)驗(yàn)大鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化

從表3可看出，力竭運(yùn)動(dòng)引起實(shí)驗(yàn)大鼠外周血力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠外周血CD3＋T、CD4＋T在T淋巴細(xì)胞所占百分比及CD4＋/CD8＋比均非常顯著下降（P＜0.01）。灌服香菇多糖或（和）有氧運(yùn)動(dòng)可使CD3＋T百分比顯著上升（P＜0.05）。而CD4＋T百分比數(shù)值雖有上升但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此現(xiàn)象也出現(xiàn)在CD4＋/CD8＋比值上。過服藥＋有氧＋力竭組CD4＋/CD8＋比值較一次力竭組卻是有差異的（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠力竭時(shí)間的影響

一次運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間是反映運(yùn)動(dòng)能力的常用指標(biāo)，而運(yùn)動(dòng)能力的提高是動(dòng)物及人體抗疲勞能力加強(qiáng)最有力的宏觀表現(xiàn)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌服香菇多糖能使大鼠力竭時(shí)間明顯延長(zhǎng)這結(jié)果與史亞麗等人的研究結(jié)果一致［10］。而李其久等人更發(fā)現(xiàn)隨著香菇多糖劑量增加，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間漸延長(zhǎng)，呈現(xiàn)劑量依賴性；中劑量組游泳時(shí)間較對(duì)照組有差異性（P＜0.05），高劑量組游泳時(shí)間則得到非常顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）［11］。香菇多糖能延長(zhǎng)力竭時(shí)間，其原因之一應(yīng)該是香菇多糖作為一種特殊的碳水化合物，能顯著增加肌、肝糖原的儲(chǔ)備和恢復(fù)，維持運(yùn)動(dòng)時(shí)血糖水平，從而保證運(yùn)動(dòng)中的氧化供能，提高運(yùn)動(dòng)能力。

3.2 香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)改善大鼠的臟器指數(shù)

臟器指數(shù)是指臟器重量所占體重的百分比，是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和內(nèi)臟的病變情況的指標(biāo)之一，可在內(nèi)外因素?fù)p傷臟器后發(fā)生明顯變化［12］。其中，脾臟指數(shù)是反映動(dòng)物免疫功能最直觀的指標(biāo)，廣泛用于機(jī)體整體免疫狀態(tài)的評(píng)價(jià)。本研究發(fā)現(xiàn)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)使大鼠脾臟指數(shù)下降，灌服香菇多糖及有氧運(yùn)動(dòng)可使下降趨勢(shì)改善，同時(shí)灌服香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)時(shí)此趨勢(shì)更明顯，但均無顯著性差異。既往研究也發(fā)現(xiàn)過量運(yùn)動(dòng)損傷免疫器官致脾臟指數(shù)降低［13］。而本研究首次發(fā)現(xiàn)香菇多糖能改善過量運(yùn)動(dòng)后的脾臟指數(shù)降低，提示香菇多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠免疫器官有保護(hù)作用。同時(shí)，值得注意的是，無論是運(yùn)動(dòng)后脾臟指數(shù)下降，還是香菇多糖及有氧運(yùn)動(dòng)改善這下降趨勢(shì)均無顯著性差異，說明臟器指數(shù)能保持相對(duì)穩(wěn)定，其生物學(xué)意義可能是生物有適應(yīng)能力，過量運(yùn)動(dòng)后可保持生物學(xué)功能相對(duì)穩(wěn)定，有利于保持運(yùn)動(dòng)能力。

3.3 香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠免疫器官的保護(hù)作用

脾臟作為體液免疫和細(xì)胞免疫的關(guān)鍵部位，是機(jī)體重要的免疫器官，在維持機(jī)體非特異性與特異免疫功能中起著舉足輕重的作用。而劇烈且持續(xù)的運(yùn)動(dòng)后，物質(zhì)氧化增速，無氧代謝急劇增多，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，引起運(yùn)動(dòng)性疲勞，并導(dǎo)致包括脾臟在內(nèi)的多處器官組織的胞損傷。體內(nèi)存在一套包括SOD、GSH－PX等酶在內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，可使有效清除自由基，間接或直接保護(hù)組織細(xì)胞免于損傷，在生理狀態(tài)下維持氧化和抗氧化的平衡。本研究顯示，一次力竭運(yùn)動(dòng)使大鼠脾組織抗氧化酶活性降低，尤其是T－SOD和TAOC，MDA非常顯著升高，提示劇烈運(yùn)動(dòng)后抗氧化酶在清除自由基時(shí)被極度消耗并產(chǎn)生大量過氧化產(chǎn)物MDA，脾臟損傷在所難免。而本研究又表明灌服香菇多糖或有氧運(yùn)動(dòng)不僅都可顯著改善力竭大鼠CAT及MDA等指標(biāo)，甚至使CAT比對(duì)照組還顯著地高，說明香菇多糖或有氧運(yùn)動(dòng)的確能改善抗氧化系統(tǒng)功能，提高機(jī)體清除自由基的效率，并發(fā)揮保護(hù)脾臟的作用。既往研究則發(fā)現(xiàn)與香菇多糖屬同一類的蕨麻多糖也能改善力竭大鼠脾臟、胸腺部分抗氧化指標(biāo)［13］。本研究還發(fā)現(xiàn)CAT及T－AOC在服藥＋有氧＋力竭組與服藥＋力竭組和有氧＋力竭組比較時(shí)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組即安靜時(shí)已無明顯差異，提示香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)在改善力竭大鼠抗氧化狀態(tài)、保護(hù)脾臟方面有協(xié)同作用，配合時(shí)則較單獨(dú)使用時(shí)更顯著改善指標(biāo)，能使指標(biāo)恢復(fù)至安靜時(shí)正常水平，也說明對(duì)抗運(yùn)動(dòng)損傷需要多種手段綜合使用。這為競(jìng)技體育中運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練時(shí)減輕運(yùn)動(dòng)性疲勞、預(yù)防大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后的免疫功能和免疫器官受損提供了新的可能和思路。

3.4 香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)影響T淋巴細(xì)胞亞群變化

成熟的T淋巴細(xì)胞按其表面特有標(biāo)志CD分子分為CD4＋和CD8＋兩大細(xì)胞亞群，可調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞免疫功能，協(xié)調(diào)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，發(fā)揮防病抗病功能。CD3＋和CD4＋共同發(fā)揮誘導(dǎo)和輔助增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用，已成為臨床上檢測(cè)免疫功能的常規(guī)指標(biāo)，而CD8＋在免疫應(yīng)答中起抑制作用，CD4＋/CD8＋則是免疫功能低下的敏感指標(biāo)，其比值升高則表明免疫應(yīng)答的正向調(diào)節(jié)占優(yōu)勢(shì)［14］。本研究中，力竭大鼠血CD3＋T、CD4＋T在T淋巴細(xì)胞所占百分比及CD4＋/CD8＋比均顯著下降，驗(yàn)證了劇烈運(yùn)動(dòng)后免疫抑制的存在。灌服香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)可使CD3＋T、CD4＋T及CD4＋/CD8＋改善，但僅CD3＋T比有顯著性差異，表明香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后的免疫應(yīng)答正向調(diào)節(jié)，增強(qiáng)免疫力，但只能部分糾正運(yùn)動(dòng)性免疫抑制。服藥＋有氧＋力竭組CD4＋/CD8＋比值較一次力竭組有顯著差異，再次提示香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)方面有協(xié)同作用，可明顯改善力竭大鼠運(yùn)動(dòng)性免疫功能低下，對(duì)指導(dǎo)運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練、預(yù)防大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后的免疫功能受損有裨益。李永峰等則發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液和有氧運(yùn)動(dòng)均可改善力竭大鼠CD4＋T百分率和CD4＋/CD8＋比降低的趨勢(shì)，且兩者有協(xié)同作用，故認(rèn)為兩者有預(yù)防力竭運(yùn)動(dòng)后免疫功能降低的作用［15］。

4 結(jié) 論

綜上所述，香菇多糖能延長(zhǎng)力竭大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間，提高運(yùn)動(dòng)能力；能部分糾正力竭大鼠脾臟指數(shù)的降低，改善大鼠CAT等抗氧化指標(biāo)，發(fā)揮保護(hù)免疫器官之作用；可改善力竭大鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化并促進(jìn)免疫應(yīng)答正向調(diào)節(jié)，增強(qiáng)免疫力。因此，把香菇多糖開發(fā)成為一種運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑是完全有可能的，很值得進(jìn)一步研究。這對(duì)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和競(jìng)技體育提供了新的有益嘗試，也是在更大程度上發(fā)揮祖國醫(yī)學(xué)寶貴財(cái)富和生物資源的新努力。而有氧運(yùn)動(dòng)也顯示出類似作用。尤為重要的是香菇多糖和有氧運(yùn)動(dòng)在上述三方面有協(xié)同作用。也說明對(duì)抗運(yùn)動(dòng)損傷需要多種手段綜合使用。這為競(jìng)技體育中運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練比賽時(shí)減輕運(yùn)動(dòng)性疲勞、預(yù)防大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后的免疫功能和免疫器官受損提供了新的綜合手段和思路。

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