維生素D3對三硝基苯磺酸誘導的大鼠結腸炎的作用*

譚 蓓 戴張晗 呂 紅 王 鷗 楊 紅 錢家鳴#

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院消化內科1(100730)內分泌科 衛生部內分泌重點實驗室2

目前認為炎癥性腸病(IBD)是以遺傳易感性為基礎，環境因素參與，黏膜免疫系統對腸腔內抗原物質(如共生菌)的異常免疫應答而造成的腸道損傷。近年研究發現，除具有調節鈣、磷代謝的傳統作用外，維生素D(VitD)還具有抗感染和調節免疫的作用［1］。IBD患者普遍存在VitD缺乏，且與病情程度相關［2］，目前兩者的關系日漸受到關注。本研究采用三硝基苯磺酸(TNBS)誘導大鼠結腸炎模型，通過給予不同劑量VitD3干預，旨在探討VitD3對大鼠實驗性結腸炎的療效及其作用機制。

材料與方法

一、實驗動物、主要試劑

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠66只，4～8周齡，體質量0.20～0.25 kg，購自北京大學醫學部實驗動物科學部，于北京協和醫院動物中心SPF級實驗室飼養。

TNBS、活性 VitD31，25(OH)2D3購自 Sigma 公司;5-氨基水楊酸(5-ASA)為德國Dr.Falk Pharma GmbH生產的美沙拉嗪灌腸液;VitD3(商品名:英康利)購自上海信誼金朱藥業有限公司。髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq PCR MasterMix均購自天根生化科技(北京)有限公司。

二、研究方法

1.結腸炎模型的建立和藥物干預:將大鼠隨機分為11組，每組各6只。根據Morris等［3］的方法，將TNBS 100 mg/kg溶于50%乙醇溶液0.25 mL后灌腸各組大鼠(除外空白對照組)，以制備結腸炎模型。造模24 h后開始藥物干預，具體方法見表1。造模第10 d處死大鼠，心臟取血和采集結腸組織。

2.結腸炎病情評估:每日觀察大鼠體質量變化、大便性狀和隱血等情況，行疾病活動指數(DAI)評分［4］。取距肛門3 cm至回盲部的結腸，行大體損傷評分［5］。取距肛門4～5 cm結腸組織，4%甲醛固定，行HE染色，評估組織病理學評分［6］。取距肛門3～4 cm結腸組織，以0.9%NaCl溶液混合后勻漿，按照試劑盒說明書檢測MPO活性。

3.RT-PCR 檢測T-bet、GATA-3 mRNA 表達:取距肛門5 cm起的結腸組織約20 mg，提取結腸組織總RNA，逆轉錄酶逆轉錄為 cDNA，行PCR擴增。各目的基因引物序列［7］見表2，均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。PCR反應體系25μL，反應條件:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，各自退火溫度退火30 s，72℃延伸1 min，共45個循環;72℃延伸5 min。擴增產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Quantity One軟件分析各條帶平均灰度值，比較目的條帶與內參照條帶比值，行半定量分析。

表1 各組大鼠藥物干預情況

表2 目的基因引物序列、擴增片段和退火溫度

4.不良反應監測:心臟取血5 mL，離心分離血清，采用日本Olympus AU-5400全自動生化儀測定鈣和肌酐水平。

三、統計學分析

應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以ˉx±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，若存在統計學意義，進一步兩兩比較應用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、結腸炎模型

造模后大鼠均出現腹瀉、血便、體質量減輕等癥狀;可見腸壁增厚、充血糜爛、活動期潰瘍，甚至腸腔狹窄、透壁性潰瘍、與周圍組織黏連等;結腸上皮層局部黏膜缺失，固有層腺體破壞，黏膜下層大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤(見圖1)。與空白對照組相比，TNBS組DAI評分、大體損傷評分、組織病理學評分和MPO活性均明顯升高(P＜0.001)(見表3)。

表3 各組大鼠DAI、大體損傷和組織病理學評分、MPO活性以及T-bet、GATA-3 mRNA表達±s)

表3 各組大鼠DAI、大體損傷和組織病理學評分、MPO活性以及T-bet、GATA-3 mRNA表達±s)

*與空白對照組比較，P＜0.001;#與TNBS組比較，P＜0.05;▲與5-ASA組比較，P＜0.05

組 別 例數 DAI評分 大體損傷評分GATA-3 0 0.02±0.02 0 0.38±0.15 TNBS組 6 3.40±0.56* 7.83±2.04* 4.00±0.71* 0.52±0.09* 0.07±0.18 0.37±0.14 5-ASA組 6 3.00±0.77 5.67±1.63 2.58±0.49# 0.15±0.06# 0 0.55±0.15#常規劑量VitD3組 6 2.82±1.52 7.33±1.75 3.08±1.11 0.13±0.03# 0.05±0.06 0.38±0.11常規劑量VitD3+5-ASA組 6 2.38±1.42 6.50±4.28 2.83±1.60 0.12±0.04# 0.08±0.12 0.38±0.19單次大劑量VitD3組 6 2.43±1.23 6.67±1.63 3.42±0.97 0.10±0.03# 0 0.46±0.18單次大劑量VitD3+5-ASA組 6 2.00±0.91 3.40±2.88# 2.10±1.02# 0.11±0.01# 0 0.22±0.06連續大劑量VitD3組 6 2.98±1.28 7.00±2.00 3.42±0.86 0.24±0.12# 0 0.56±0.12#連續大劑量VitD3+5-ASA組 6 2.33±2.00 3.17±3.19# 1.00±1.38#▲ 0.12±0.05# 0 0.48±0.14活性VitD3組 6 2.35±0.97 6.17±3.43 2.92±1.24 0.26±0.13# 0.05±0.08 0.32±0.17活性VitD3+5-ASA組 6 3.27±1.09 6.83±3.19 3.17±1.37 0.21±0.14#mRNA空白對照組組織病理學評分MPO活性(U/g組織)T-bet mRNA 6 0 0 0.03±0.07 0.43±0.21

二、藥物干預對結腸炎的影響

各藥物干預組結腸壁充血、潰瘍、狹窄、黏連以及結腸上皮黏膜缺失、細胞浸潤等情況均較TNBS組有所減輕(見圖1)。與TNBS組相比，各藥物干預組DAI評分雖下降，但差異無統計學意義(P＞0.05);單次大劑量VitD3+5-ASA組、連續大劑量VitD3+5-ASA組大體損傷評分明顯下降(P=0.007和P=0.003);5-ASA組、單次大劑量VitD3+5-ASA組和連續大劑量VitD3+5-ASA組組織病理學評分明顯下降(P=0.026、P=0.005和P＜0.001);各藥物干預組MPO活性均明顯下降(P＜0.001)。聯合5-ASA后，各組DAI、大體損傷評分、組織病理學評分和MPO活性與5-ASA組相比均無明顯差異(P＞0.05)，連續大劑量VitD3+5-ASA組組織病理學評分較5-ASA組明顯下降(P=0.013)(見表3)。

圖1 各組大鼠結腸組織病理(HE染色 ×100)

三、T-bet、GATA-3 mRNA 表達

1.T-bet mRNA表達:T-bet在空白對照組無表達，TNBS組表達較弱，兩組相比差異無統計學意義(P=0.101)。各藥物干預組T-bet mRNA表達與TNBS組相比差異均無統計學意義(P＞0.05)，其中5-ASA組、單次大劑量VitD3組、單次大劑量VitD3+5-ASA組、連續大劑量VitD3組、連續大劑量VitD3+5-ASA組表達均缺失(見表3、圖2)。

2.GATA-3 mRNA表達:與空白對照組相比，TNBS組GATA-3 mRNA表達無明顯差異(P=0.838)。與TNBS組相比，5-ASA組(P=0.037)、連續大劑量VitD3組(P=0.035)表達明顯升高，其余藥物干預組無明顯差異(見表3、圖2)。

圖2 各組大鼠結腸組織T-bet、GATA-3 mRNA表達的電泳圖

四、不良反應監測

連續大劑量 VitD3組、連續大劑量 VitD3+5-ASA組大鼠出現高鈣血癥，血鈣水平明顯高于其余各組(P＜0.05)。所有組別大鼠肌酐水平均在正常范圍內［8］，但連續大劑量 VitD3組血肌酐水平明顯高于其余各組(P＜0.05)(見表4)。

表4 各組大鼠血鈣和血肌酐水平±s)

表4 各組大鼠血鈣和血肌酐水平±s)

?與連續大劑量VitD3組比較，P＜0.05;※與連續大劑量 VitD3+5-ASA組比較，P＜0.05

組 別 例數 血鈣(mmol/L)血肌酐(μmol/L)空白對照組 6 2.58±0.95?※ 22.60±2.07?TNBS組 6 2.59±0.12?※ 20.00±6.92?5-ASA 組 6 2.63±0.08?※ 21.72±3.24?常規劑量 VitD3組 6 2.48 ±0.17?※ 18.77±2.89?常規劑量VitD3+5-ASA組 6 2.40±0.16?※ 21.55±7.84?單次大劑量VitD3組 6 2.66±0.12?※ 19.28±3.26?單次大劑量VitD3+5-ASA組 6 2.44±0.05?※ 17.70±1.67?連續大劑量VitD3組 6 3.36±0.30 28.82±10.61連續大劑量VitD3+5-ASA組 6 3.15±0.30 21.95±7.05?活性 VitD3組 6 2.62 ±0.15?※ 22.18±3.42?活性VitD3+5-ASA組 6 2.61±0.23?※ 21.93±4.64?

討 論

1989年Morris等［3］首次提出以TNBS法制備大鼠結腸炎模型，TNBS是一種半抗原物質，在乙醇破壞腸黏膜屏障后，與腸黏膜角蛋白結合成為全抗原，激發局部免疫反應，造成與人類IBD相似的實驗性結腸炎。MPO是中性粒細胞嗜天青顆粒中的酶之一，與急性炎癥的嚴重程度呈正相關。本研究以TNBS誘導后大鼠均出現腹瀉、血便、體質量下降，結腸壁增厚、充血糜爛和潰瘍，并伴有大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，大體損傷評分和組織病理學評分、MPO活性均明顯升高，表明TNBS成功誘導了實驗性結腸炎。

目前VitD3的推薦劑量主要針對普通人群預防和治療骨質疏松，尚缺乏VitD3對IBD患者起免疫調節作用所需劑量的相關數據。因此，本研究采用常規劑量、單次大劑量和連續大劑量VitD3三種不同劑量梯度以觀察大鼠炎癥改善情況。結果顯示不同劑量VitD3干預組MPO活性均較TNBS組明顯下降，表明VitD3可減輕腸道中性粒細胞浸潤的急性炎癥。其中單次或連續大劑量VitD3聯合5-ASA的療效較常規劑量VitD3更為突出，表現為大體損傷和組織病理學評分較TNBS組明顯減輕，而常規劑量VitD3組與TNBS無明顯差異。然而隨著VitD3劑量增加，不良反應亦增多，連續大劑量VitD3導致血鈣和血肌酐水平均明顯升高。目前有研究［9，10］應用VitD3類似物治療IBD，均取得良好的療效，為將來增加VitD3治療劑量提供了一定依據。

傳統上將CD4+T細胞分為Th1和Th2細胞，其分化受轉錄因子影響。T-bet是Th1型免疫的關鍵調節因子［11］，GATA-3是一種鋅指蛋白，為Th2的關鍵調節因子［12］。Th1/Th2細胞比例失衡在IBD發病中起重要作用。TNBS誘導的實驗性結腸炎以Th1為主，類似于人類克羅恩病(CD)，抑制T-bet表達而上調GATA-3表達可影響T細胞從Th1細胞向Th2細胞的分化。有研究發現VitD3具有免疫調節作用，Daniel等［13］發現活性 VitD3和活性 VitD3+地塞米松組中GATA-3表達分別是TNBS實驗性結腸炎小鼠的2倍和5倍，且活性VitD3聯合地塞米松較單用地塞米松可明顯下調T-bet。本研究中，空白對照組不表達T-bet，TNBS組弱表達，符合TNBS誘導的實驗性結腸炎以Th1為主，單次或連續大劑量VitD3聯合5-ASA均可使 T-bet表達缺失，同時5-ASA、連續大劑量VitD3可上調 GATA-3表達，因此考慮VitD3可能通過Th1/Th2平衡調節T細胞免疫。

本研究中，活性VitD3組補充的1，25(OH)2D3僅為常規劑量，其對大鼠大體、組織學和T細胞免疫均未表現出明顯的治療作用。因而，考慮VitD3所表現出的減輕炎癥作用與劑量而非劑型相關，活性VitD3價格相對昂貴，臨床上可選擇普通VitD3并適當增加補充劑量。

本研究中，應用5-ASA雖在T細胞免疫和組織學評估中表現出一定治療效果，但并未能使大體損傷較TNBS組明顯減輕，與臨床上5-ASA治療CD的效果相一致。而5-ASA聯合大劑量VitD3后，大鼠結腸炎組織病理學進一步減輕，提示在IBD臨床治療中輔以中-高劑量VitD3或許能提高傳統藥物的治療效果，起較好的協同作用。

此外，本研究中TNBS組大體損傷和組織病理學評分均明顯高于空白對照組，但T-bet和GATA-3 mRNA表達與空白對照組無明顯差異，原因可能為大鼠于造模后第10 d處死時，其實驗性結腸炎已趨于慢性化且存在自愈趨勢，故炎性因子水平已有所下降，但組織學修復需一定過程，故遲于炎性因子變化。

綜上所述，VitD3可減輕TNBS誘導的實驗性結腸炎急性炎癥，單次和連續大劑量VitD3聯合5-ASA可進一步明顯減輕大體損傷和組織病理學炎癥，單次或連續大劑量VitD3及其聯合5-ASA可下調T-bet表達，5-ASA和連續大劑量 VitD3上調 GATA-3表達，但VitD3劑量過大會引發高鈣血癥和肌酐升高。說明VitD3可通過調節T細胞免疫減輕TNBS誘導的實驗性結腸炎，但具體機制仍有待進一步研究證實，并控制不良反應的發生。

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