HPLC法測定鹽酸米諾環素緩釋片在犬體內的血漿濃度及其藥動學研究

劉統斌，鄔向東，楊東菁，王雪芹（1.上?，F代哈森（商丘）藥業有限公司，河南商丘476000；.河南中帥醫藥科技發展有限公司，鄭州 45000；.河南大學醫學院，河南開封 475001；4.河南省食品藥品檢驗所，鄭州45000）

鹽酸米諾環素（M inocycline Hydrochloride，MH）為半合成四環素類廣譜抗菌藥物，具有高效、長效的特點。在四環素類抗菌藥物中，本品的抗菌作用最強，抗菌譜與四環素相近而且對四環素耐藥性金黃色葡萄球菌也有效。參照文獻和我國新藥審批辦法中的有關規定[1～6]，筆者建立了高效液相色譜（HPLC）法測定犬血漿中的鹽酸米諾環素含量，并對鹽酸米諾環素緩釋片（以羥丙基甲基纖維素為骨架）與進口參比制劑在Beagle犬體內的藥動學進行對比研究，以闡釋鹽酸米諾環素緩釋片的緩釋特征，為處方篩選和臨床研究提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CP225D型電子天平（德國賽多利斯公司）；LC-6A HPLC儀，包括紫外檢測器（日本島津公司）。

1.2 試藥

鹽酸米諾環素對照品（批號：091001，含量：84.01%，使用前不需要干燥處理）和鹽酸米諾環素緩釋片（批號：20100508-1，規格：按米諾環素計每片90mg）均由河南中帥醫藥科技發展有限公司提供；進口鹽酸米諾環素緩釋片（美國BarrLaboratories公司，批號：701550，規格：按米諾環素計每片90mg）；咖啡因（中國食品藥品檢定研究院，批號：171215-200406，純度：99%）；乙腈、庚烷磺酸鈉為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

Beagle犬，體重9～11 kg，♀♂各半，購自南京市安立默科技發展有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2005-0003。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Scienhome C18（200mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-四氫呋喃-水（含1.5%三乙胺、2%庚烷磺酸鈉，磷酸調pH至 3.0）＝150 ∶30 ∶850（V/V/V），流速：1.0 m L·min－1；柱溫：35℃；檢測波長：280 nm；進樣量：50μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 貯備液的制備。稱取鹽酸米諾環素對照品適量，先用甲醇溶解，再用流動相稀釋制成濃度為500mg·L－1的溶液作為對照品貯備液；另取咖啡因（內標）適量，同法制成濃度為0.5mg·L－1的溶液作為內標貯備液，分別置于冰箱冷藏保存。2.2.2 對照品血漿的制備。先將濃度為500mg·L－1的對照品貯備液，依次用流動相稀釋成含鹽酸米諾環素250、125、50、25、12.5、6.25、3.125mg·L－1的對照品溶液，再加入內標貯備液和空白血漿，制備成含鹽酸米諾環素 10、5、2、1、0.5、0.25、0.125mg·L－1的對照品血漿。

2.3 血漿樣品的處理與測定

取血漿樣品0.5m L，加入濃度為0.5mg·L－1的內標貯備液100μL、pH7.2磷酸鹽緩沖液1m L，渦旋0.5m in，加乙酸乙酯5 m L，渦旋3 m in，3 500 r·m in－1離心10 m in，吸取上清液 4.0 m L，再于40℃水浴中N2吹干。加流動相100μL，渦旋2min，12 000 r·m in－1高速離心10m in，取上清液按“2.1”項下色譜條件測定鹽酸米諾環素的峰面積，以內標法進行定量分析。

2.4 系統適用性試驗

在“2.1”項色譜條件下，取給藥前犬的空白血漿、對照品血漿、犬給藥后2 h血漿樣品，按“2.3”項下方法處理并進樣測定。結果表明，鹽酸米諾環素達到基線分離，與血漿樣品中的內標及雜質峰分離良好，保留時間約為6.42m in，內標咖啡因保留時間約為4.78min。色譜詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.對照品血漿；C.血漿樣品（給藥后2 h）；1.鹽酸米諾環素；2.內標Fig 1 HPLC chromatograms A.blank plasma；B.controlsubstance plasma；C.plasma sample（2 h after adm inistration）；1.MH；2.internalstandard

2.5 標準曲線與定量范圍考察

取空白血漿0.5m L，精密加入內標和不同量的鹽酸米諾環素對照品溶液，使其含鹽酸米諾環素分別為0.125、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10mg·L－1，再按“2.3”項下方法處理，照“2.1”項下色譜條件進樣測定，以濃度c（mg·L－1）為橫坐標，鹽酸米諾環素與內標的峰面積比值R為縱坐標進行線性回歸。得回歸方程為R＝0.219 9c+0.036 6（r＝0.999）。結果表明，鹽酸米諾環素的檢測濃度的線性范圍為0.125～10mg·L－1，定量下限為0.125mg·L－1。

2.6 回收率試驗

取不同濃度的鹽酸米諾環素對照品溶液，加空白血漿制備成濃度為5、1、0.25mg·L－1的血漿樣品，每個濃度各5份，以相應濃度的對照品溶液為對照，由二者峰面積之比計算鹽酸米諾環素提取回收率和二者濃度之比計算方法回收率。結果，鹽酸米諾環素的平均提取回收率為70.3%，平均方法回收率為89.3%。

2.7 進樣重復性與精密度考察

按“2.6”項下方法制備5、1、0.25mg·L－1的血漿樣品，照“2.3”項下方法處理，于同日內處理測定5次；另每日處理測定1次，連續測定3 d，計算日內和日間RSD。結果，本方法的日內RSD≤5.3%，日間RSD≤6.4%。

2.8 樣品穩定性試驗

按“2.6”項下方法制備5、1、0.25mg·L－1的血漿樣品，分別分組處理如下：（1）新鮮制備組：立即按“2.3”項下方法處理血漿樣品，并進樣測定；（2）短期室溫穩定性組：將制備好的血漿樣品室溫放置10 h后，再按“2.3”項下方法處理、測定；（3）反復凍融組：將在－20℃下冷凍的血漿樣品取出室溫復融，反復3次后再按“2.3”項下方法處理、測定；（4）－20℃冷凍儲存組：將血漿樣品置于－20℃中冰凍20 d后，再按“2.3”項下方法處理、測定；（5）處理后樣品組：血漿樣品按“2.3”項下方法處理后室溫放置10 h，再進樣測定。結果，在上述條件下，RSD均＜15%，表明血漿樣品穩定性良好，滿足生物樣品的分析要求。

將鹽酸米諾環素貯備液分別放置0、7、14 d后，按“2.2.2”項下方法制備成濃度為1mg·L－1的溶液，進樣測定，根據鹽酸米諾環素峰面積及其與內標峰面積的比值變化情況評價貯備液的穩定性。結果，鹽酸米諾環素峰面積的RSD及其與內標峰面積的比值的RSD均＜3.96%，說明鹽酸米諾環素貯備液的穩定性較好。

2.9 樣品的采集與測定

取犬分為受試制劑（國產）組和參比制劑（進口）組，每組5只，禁食不禁水，14 h后灌胃給予相應鹽酸米諾環素緩釋片18 mg·kg－1（按臨床常用劑量換算），給藥后繼續禁食6 h，分別于給藥前和給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、60 h采集各組犬前肢靜脈血4m L，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，分離血漿，按“2.3”項下方法處理血漿，以鹽酸米諾環素作為檢測對象，用HPLC法測定血漿樣品中鹽酸米諾環素的濃度。另經1周的清洗期后，同法進行交叉實驗，繪制2種制劑在犬體內的平均藥-時曲線，結果見圖2。

用DAS 2.0藥動學軟件計算2種制劑在犬體內的藥動學參數。結果，受試制劑和參比制劑的tmax分別為（4.42±1.24）、（4.33±1.07）h，cmax分別為（4.29±1.13）、（4.34±0.83）mg·L－1，t1/2分別為（22.17±5.73）、（20.09±4.94）h，AUC0～60h分別為（48.19±16.64）、（48.31±15.00）mg·h·L－1，AUC0～∞分別為（54.81±16.39）、（53.62±16.01）mg·h·L－1。表明2種制劑在犬體內的藥動學參數無明顯差異。

3 討論

圖2 2種制劑在犬體內的平均藥-時曲線Fig 2 M ean p lasma concentration-time curves of 2 preparations in dogs

鹽酸米諾環素制成緩釋片用于治療12周歲以上非結節性中度或重度尋常性痤瘡炎癥損傷患者。本次實驗選擇化學穩定性好的咖啡因為內標[7]。用乙酸乙酯處理樣品，既能夠有效提取待測成分，又能夠有效去除樣本中基質對色譜柱和儀器的污染，方法簡單，樣品需要量少，適合大批量生物樣品濃度的檢測。

綜上所述，本方法專屬性強、靈敏度高，可有效檢測犬血漿中鹽酸米諾環素濃度；國產與進口鹽酸米諾環素緩釋片比較藥動學參數無明顯差異。

[1]國家食品藥品監督管理局.化學藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則[S].2005.

[2]國家食品藥品監督管理局.化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術指導原則[S].2005.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅩⅨB.

[4]齊 靖，蔣海松，吳琳華.HPLC法測定鹽酸米諾環素緩釋片主藥的含量[J].中國藥房，2009，20（10）：781.

[5]高守紅，溫 燕，鄔 蓉，等.注射用鹽酸米諾環素在健康人體的藥物動力學[J].藥學實踐雜志，2009，27（3）：193.

[6]宋慶翠，湯 震，仇益群.米諾環素膠囊對人體相對生物利用度的研究[J].中國藥業，2001，10（2）：27.

[7]周玲潔，顧麗華，王以儉，等.米諾環素注射劑的藥動學[J].中國新藥與臨床雜志，2005，24（10）：798.