多塞平對骨癌疼痛模型大鼠的鎮痛作用研究

姚 旌，王 林，陸 魏（貴陽醫學院附屬醫院疼痛診療中心，貴陽 550004）

根據世界衛生組織的資料，癌癥的發病人數在2007年已經達到1.15億，預計到2030年將達到1.55億，其中30%～50%的患者將會經歷疼痛，雖然根據世界衛生組織“階梯療法”使用嗎啡、糖皮質激素以及解熱鎮痛藥治療可以使90%的患者減輕痛苦，但是嗎啡會產生耐受以及成癮[1]，所以尋找治療癌痛的高效、低副作用的藥物是目前研究熱點。三環類抗抑郁藥從20世紀60年代開始一直用于抑郁癥的治療，其作用機制為阻滯去甲腎上腺素和血清素的再攝取，從而增加了這些神經遞質的濃度以便于其相應的突觸后受體結合產生效應[2]。目前，三環類抗抑郁藥如多塞平，已發現其對于急性及慢性疼痛均具有鎮痛作用，如術后疼痛、腰痛、神經源性疼痛等；且其鎮痛作用的劑量明顯低于抗抑郁作用[3]。有報道[4]頭頸部放療后產生口腔黏膜炎的患者在使用多塞平洗劑漱口以后不僅改善了口腔黏膜炎的癥狀，還產生了鎮痛作用。所以筆者研究了多塞平對骨癌疼痛模型大鼠的鎮痛作用，以期為其使用提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子測痛儀（意大利Ugo Basile公司）；細胞操作超凈臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 試藥

多塞平原料藥（福達化工有限公司，批號：101109，純度：99.99%）；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號：090306，規格：每瓶5 g）；無菌骨蠟（北方三友醫療器械有限公司，批號：100223110）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：09100229）。

1.3 細胞與實驗動物

人乳腺癌Walker256細胞株，上海艾研生物科技有限公司提供，一直凍存于液氮罐中。SD大鼠，90只，體重150～170 g，♀；SD幼年大鼠1只，體重70 g，♀，均由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（滬）2008-0003。

2 方法

2.1 劑量設定

Wordliczek等[5]進行了鞘內注射多塞平治療大鼠福爾馬林誘發疼痛的研究，研究結果表明多塞平的最大有效劑量為1 000μg·kg－1，所以筆者根據其結果，選定多塞平的最高劑量為1 000μg·kg－1，陽性藥物嗎啡的劑量則設定為與其最高劑量相同的1 000 μg·kg－1。根據Gong等[6]的量效曲線關系劑量設定原則，設定了從最高劑量1 000μg·kg－1以下5個劑量，即多塞平3、10、30、100、300、1 000 μg·kg－1，來繪制量效曲線，計算其最大鎮痛效應（Emax）以及半數有效量（ED50）。

2.2 細胞的制備

取出Walker256細胞凍存管，放入37℃燒杯中快速解凍。吸出細胞懸液，加無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）使細胞懸浮，1 500 r·m in－1離心3m in，棄上清，重復漂洗1次，加適量無菌PBS，調整細胞數為107個/m L。取幼年大鼠1只，抽0.5m L Walker 256細胞接種于其腹腔中。7 d后待幼鼠出現腹水癥時，抽取含腫瘤細胞的腹水，將收集到的腹水1 500 r·min－1離心3m in，棄上清，用無菌PBS沖洗后再以1 500 r·m in－1離心3 min，然后用無菌PBS調整細胞數為5×104個/μL，備用。

2.3 骨癌疼痛模型的建立

取大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg·kg－1）麻醉，消毒其左側脛骨下1/3皮膚，切開皮膚，分離肌肉，暴露脛骨骨面。用滅菌7號針頭垂直于骨表面鉆孔后，用50μL微量進樣器深刺入骨髓腔，緩慢注入10μL“2.2”項下制備的含Walker256的大鼠細胞液，用無菌骨蠟封孔并逐層消毒縫合，整個手術過程和相關手術器械均嚴格按照無菌手術要求執行[7]。

2.4 模型的檢測

待造模后，將大鼠置于網格架臺上，適應環境30m in，使用電子測痛儀測量造模同側腳以及造模對側腳刺激后腳抬起的閾值，作為大鼠的痛閾值，單位為g，當造模同側腳痛閾值＜5 g即為造模成功。

2.5 蛛網膜下腔插管方法

大鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，背部剪毛、消毒，從髂骨正中向上下分別劃開皮膚1 cm，用不銹鋼套管（內套PE-10導管）在L4和L5之間垂直刺入椎管，此時大鼠的尾巴或后肢會出現輕微抽動，改變不銹鋼管的方向，將套管尖端指向大鼠頭端送入脊髓蛛網膜下腔至腰膨大水平，拔套管，縫合局部組織以固定管，頸部皮膚剪小口，PE管經皮下由此穿出，縫合頸部局部皮膚組織，固定，術后單籠飼養[6]。

2.6 鎮痛作用研究

取90只大鼠分為正常組、模型組、嗎啡（1 000 μg·kg－1）和多塞平3、10、30、100、300、1 000 μg·kg－1劑量組，每組10只，除正常組10只外均需造模。于造模后1、5、10、15、20、25、30 d測定各組大鼠兩側足底的痛閾值。待第30天模型穩定后，行蛛網膜下腔插管。到第31天，使用電子測痛儀測量造模同側腳以及造模對側腳的基礎痛閾值，記錄為基礎值，然后各組大鼠經導管單次鞘內注射相應劑量藥物，正常組及模型組給予等容量生理鹽水，分別于給藥后0.5、1、2、4 h測量各組大鼠兩側足底的痛閾值。

2.7 數據處理

采用GraphPad Prism 5.0軟件處理數據，計算出Emax和ED50，數據以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進行t檢驗。Emax＝（同側藥后痛閾值－同側基礎值）/（對側藥后痛閾值－對側基礎值）×100%。

3 結果

3.1 建模情況

大鼠脛骨注入Walker256細胞以后，痛閾值開始隨時間變化逐漸降低，到第10天顯著下降，到第15天左右下降到最低水平，當經過30 d以后，模型基本穩定，但造模對側腳的痛閾值一直無明顯變化。大鼠造模后兩側腳痛閾值變化見圖1。

圖1 大鼠建模后兩側腳痛閾值變化Fig 1 Changesof pain thresholdsof bilateral footaftermodeling

3.2 鎮痛作用

多塞平各劑量與嗎啡在給藥后0.5 h即產生鎮痛作用，給藥后1 h鎮痛作用達到高峰。多塞平各劑量組大鼠造模對側腳痛閾值無明顯變化，造模同側腳痛閾值升高與劑量呈正相關。多塞平1 000μg·kg－1劑量組在給藥后4 h時依然存在鎮痛效應。根據結果繪制量效曲線，得出多塞平鞘內注射治療骨癌疼痛的ED50為46.6 μg·kg－1，其1 000 μg·kg－1時的Emax約為67.7%，與嗎啡1 000μg·kg－1的最大鎮痛效應78.6%比較無明顯差異，具體結果見圖2、圖3、圖4。

圖2 各組大鼠給藥后對側腳痛閾值的變化Fig 2 Changes of pain thresholds of contralateral foot after medication in each group

圖3 各組大鼠給藥后同側腳痛閾值的變化Fig 3 Changes of pain thresholds of ipsilateral foot after medication in each group

圖4 鞘內注射多塞平對骨癌疼痛模型大鼠的量效曲線Fig 4 Dose-effect curves of intrathecal injection of doxepin on bone cancer pain rat

4 討論

癌癥如果預后不良，這些源于乳腺、肺、前列腺的癌癥就會轉移至骨骼，超過70%的晚期乳腺癌、前列腺癌等的患者都會發生骨轉移，表現為自發性疼痛、痛覺過敏和異常性疼痛[8]。目前研究癌痛機制主要以骨癌疼痛模型為主。在實際臨床病例觀察中，腫瘤細胞轉移到骨或原發腫瘤在骨內，都會出現劇烈的疼痛；并且隨著骨質的破壞，疼痛程度加劇。一般易發生骨轉移的腫瘤有肺癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等。應用Walker256細胞建立骨癌疼痛模型的優點有：（1）表現出與人類骨癌疼痛相似的痛覺行為；（2）疼痛程度量指標檢測容易，定量較精確；（3）模型制備成功率較高，制備過程比較容易，有較好的實用性[9]。

已經發現多塞平等三環類抗抑郁藥在動物實驗以及臨床均具有鎮痛的作用，且未見報道具有成癮性及耐受性，多塞平可以劑量依賴性地降低小鼠痛閾值，鞘內注射可以抑制小鼠福爾馬林誘發的疼痛，臨床上可用來治療神經源性疼痛等，而且癌癥疼痛患者如果聯用多塞平和阿片類鎮痛藥可以增加鎮痛效果，減少阿片類藥物的用量[10]。本實驗結果表明，大鼠造模成功疼痛只發生在造模同側腳，對于造模對側腳的痛閾值無明顯影響，與李曉青等[9]的研究結果一致。由此推測，腫瘤細胞已經在大鼠造模同側腳骨髓腔成瘤生成，并未轉移到對側腳。鞘內注射多塞平對于骨癌疼痛模型大鼠同側腳可以產生鎮痛作用，1 000 μg·kg－1的Emax與嗎啡1 000 μg·kg－1的Emax比較無明顯差異，顯示出多塞平對于骨癌疼痛具有鎮痛作用，可以作為治療癌性疼痛的一個新的選擇，但其具體的鎮痛作用機制還有待進一步研究。

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