高效液相色譜法測定飼料中的氨基酸

(天津博納艾杰爾科技有限公司，天津300462)

氨基酸對動物的生長、神經系統的發育及動物體內營養物質的正常代謝都有重要的作用，而且蛋白質是動物生長必需的營養物質，是評價飼料營養成分的一個指標，而氨基酸是構成蛋白質的基本單位，所以氨基酸的種類和含量也就是評價飼料質量的根本依據，從而準確檢測氨基酸的含量和種類具有重要意義。柱后衍生的方法，雖然準確性高，但是耗時長、靈敏度低，所以本文采用柱前衍生的方法以縮短分析時間，增加靈敏度。同時該方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存數月，克服了柱前衍生法衍生物不穩定的缺點，另外該方法準確性高，用標準品做未知樣品進行檢測，檢測的含量與標準品的標示值非常接近。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要儀器

飼料樣品1與樣品2為市售兩種不同品牌的飼料；Venusil AA氨基酸分析方法包(含衍生試劑PITC、氨基酸標準品、Venusil AA氨基酸分析專用柱4.6 mm×250 mm，5 μm)購自天津博納艾杰爾科技有限公司；氨基酸標準品(sigma公司)；水(屈臣氏4 L純凈水)、乙腈(色譜純，霍尼韋爾)；Agilent 1100高效液相色譜儀(包括紫外可變波長檢測器和高壓輸液泵)。

1.2 樣品前處理

酸水解法：準確稱取一定量的樣品，使樣品氨基酸總量在50～75mg范圍內，置于20～30 ml安瓿瓶中，加入10 ml含0.1%苯酚的6 mol/l鹽酸，振搖使樣品溶解或者是樣品均勻分散在溶液中，將安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷凍3～5 min，充氮后用噴燈熔封，然后置于(110±1)℃烘箱中水解24 h，取出冷卻，取水溶液1 ml，置于濃縮管中用濃縮儀濃縮至干，加入1 ml的0.1 mol/l稀鹽酸溶解，用0.45 μm濾膜過濾后，取上清液貯存于冰箱中，供衍生使用。

1.3 衍生方法

準確量取水解后溶液及氨基酸標準品200 μl，分別置于1.5 ml離心管中，往每只離心管中準確加入正亮氨酸內標50 μl，然后分別加入三乙胺乙腈溶液100 μl和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μl，搖勻室溫靜置衍生1 h。衍生結束后分別加入400 μl正己烷，振搖并靜置10 min，取下層溶液200 μl并用水稀釋到1 ml，混合均勻后用0.45 μm針式過濾器過濾即可。

1.4 檢測方法

1.4.1 溶液配制

流動相A：稱取15.2 g無水乙酸鈉,加水1 850 ml，溶解后用冰醋酸調pH值到6.5,然后加乙腈溶液140 ml,混合均勻并用0.45 μm濾膜過濾。

流動相B：80%乙腈水溶液。

1.4.2 高效液相檢測條件

儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀；

色譜柱：Venusil AA氨基酸分析專用柱4.6 mm×250 mm，5 μm，100 A；

流速：1 ml/min；

進樣量：10 μl；

檢測波長：254 nm；

柱溫：40℃；

檢測梯度見表1。

表1 流動相梯度變化

2 實驗結果與討論

2.1 液相條件的建立

樣品中氨基酸含量比較低，而且直接檢測溶劑效應較大，經過衍生后直接檢測樣品中的氨基酸不能完全分離，本文通過用水稀釋衍生溶液的方法降低檢測中的溶劑效應，并且經過優化流動相梯度使18種氨基酸得到良好的分離。

但是實際檢測過程中相同的檢測條件下，儀器不同，分離效果差別較大，有的甚至都完全分不開，為此本文還開發了一種基礎檢測條件，可以根據儀器的自身特點，稍加調整流動相的比例即可使18種氨基酸得到較好的分離。基礎檢測條件如表2所示。

表2 流動相基礎梯度變化

2.2 檢測方法的穩定性、線性及準確性

氨基酸標準品按照1.3節方法衍生后，相同的條件（1.4.2節）下連續重復進樣6次，計算相對標準偏差，結果如表3所示。由結果可知該方法比較穩定，可以用來檢測氨基酸樣品，其實驗圖譜如圖1所示。

表3 氨基酸的線性回歸方程、標準偏差和檢出限

根據儀器對各個物質的響應情況，將氨基酸標準溶液分別稀釋成2.5 μmol/ml(胱氨酸為1.25 μmol/ml)、1.25 μmol/ml（胱氨酸為 0.625 μmol/ml）、0.5 μmol/ml（胱氨酸為 0.25 μmol/ml）、0.25 μmol/ml(胱氨酸為0.125 μmol/ml)、0.125 μmol/ml(胱氨酸為0.0625 μmol/ml)5個濃度，然后按照1.3節的衍生方法同時衍生處理，樣品經稀釋過濾后在相同的實驗條件下（1.4.2節）進樣，依據進樣濃度X（μmol/ml)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，根據各個物質峰高、噪音，遵循S/N=3計算出最低檢出限，回歸方程及檢出限見表3?？梢姡谶x定的液相色譜條件下氨基酸標準溶液的響應與濃度呈良好的線性關系。

圖1 氨基酸標準偏差試驗色譜

為了驗證建立方法的準確性，本文用Sigma氨基酸標準品為樣品，以博納艾杰爾科技的標準品為標準品通過相同的方法（1.3節）衍生后，按照相同的條件（1.4.2節）檢測得出檢測值與標示值之間的偏差，除胱氨酸外，偏差均小于3%，接近標準品的標示值，證明該方法準確性高，檢測效果穩定。實驗結果如表4。

表4 檢測Sigma標準品的相對誤差

因為半胱氨酸在堿性環境下能夠轉化成胱氨酸，所以經堿水解后胱氨酸的含量不穩定，此外有時兩個半胱氨酸殘基會發生二硫鍵交聯，經異硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不穩定，非常容易分解，所以胱氨酸的相關系數和偏差都比較大。

2.3 樣品檢測結果

按照上述方法檢測處理后的飼料樣品可得色譜圖如圖2、圖3，通過單點校正法可以得出樣品1和樣品2中含有標準品中的17種氨基酸。

樣品中的17種氨基酸均能得到良好的分離，這說明在有基質干擾的情況下本文建立的這種方法同樣適用，而且樣品連續進樣重復性非常好，未出現樣品變質或者峰型變差的現象，證明本文建立的方法在有基質干擾的情況下也同樣克服了衍生氨基酸容易分解的問題。

3 實驗結論

按照上述實驗條件，可以準確檢測飼料樣品中17種氨基酸，同時檢測的靈敏度及線性都能滿足檢測的要求，而且本方法準確性高，與樣品中含有氨基酸的真值偏差非常小，所以該方法可以準確的檢測飼料樣品中的氨基酸。

圖2 實際樣品1色譜

圖3 實際樣品2色譜

[1]胡鑫鸚,盛翠鳳.淺議飼料分析的高效液相色譜法[J].科技資訊,2008,28(2):221.

[2]瞿其署,湯曉慶,胡效亞,等.柱前衍生法在氨基酸分析中的應用[J].化學進展，2006,18（6）：789-793.

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[4]中華人民共和國國家標準飼料中氨基酸的測定.