Ⅰ類整合子在耐多藥產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中的分布探討＊

李佩波，蔡敏泓，黃永茂，林 雁，鄒永勝，鐘 利，陳 楓，陳 莊，向成玉

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，四川 瀘州 646000）

大腸埃希菌屬于腸桿菌科，為革蘭陰性短桿菌，屬于條件致病菌，是臨床上常見的細(xì)菌感染之一。近年來，隨著β－內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等抗菌藥物在臨床上廣泛應(yīng)用、不合理使用以及濫用，導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)了不同程度的耐藥，甚至出現(xiàn)了交叉耐藥和多重耐藥的特點(diǎn)［1］。Ⅰ類整合子在大腸埃希菌中廣泛存在，整合子相關(guān)耐藥基因在該菌耐藥性的形成和播散中發(fā)揮重要作用［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌耐藥情況嚴(yán)重，尤其是產(chǎn)ESBLs酶菌株更突出［3］。本研究對臨床分離的71株大腸埃希菌進(jìn)行耐藥分析、ESBLs鑒定和Ⅰ類整合子遺傳標(biāo)記檢測，并探討其相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)菌株:71株大腸埃希菌臨床分離株（不含同一病例相同部位重復(fù)分離株）來自瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2007年10月至2008年10月期間感染大腸埃希菌的患者。其中呼吸道感染29例，泌尿系統(tǒng)感染18例，外科切口感染14例，全身感染8例，其他2例；全部菌株均重新經(jīng)VITEK系統(tǒng)（BioMerieux，法國）鑒定確認(rèn)。標(biāo)準(zhǔn)菌株:大腸埃希菌 ATCC 25922，購自國家臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗(yàn) 采用美國全國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）推薦的紙片擴(kuò)散法（K－B法）進(jìn)行臨床常用3類6種（LVE、CIP、FOX、S、A）抗菌藥物的敏感性檢測，并根據(jù) NCCLS 2006要求進(jìn)行敏感性判斷。

1.2.2 ESBLs鑒定 初步篩選試驗(yàn):選用頭孢噻肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢曲松藥敏紙片（杭州天和微生物試劑公司）對71株大腸埃希菌進(jìn)行產(chǎn)ESBLs篩選試驗(yàn)，凡頭孢他啶的抑菌環(huán)直徑小于或等于22mm，頭孢曲松小于或等于25mm，氨曲南或頭孢噻肟小于或等于27mm，則提示為可疑產(chǎn)ESBLs菌株。紙片確認(rèn)試驗(yàn):將初篩可疑產(chǎn)ESBLs菌株同時(shí)用頭孢他啶和頭孢他啶加克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟加克拉維酸作藥敏試驗(yàn)，對任何一組藥物，加克拉維酸前后抑菌環(huán)直徑相差大于或等于5mm可確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.2.3 PCR技術(shù)檢測基因 采用Biospin細(xì)菌基因組DNA試劑盒（上海生工生物技術(shù)公司）提取大腸埃希菌DNA。根據(jù)Ⅰ類整合子遺傳標(biāo)記qacE△sul1設(shè)計(jì)引物（上海生工生物技術(shù)公司提供）。上游引物基因序列P1:TAG CGA GGG CTT TAC TAA GC；下游引物基因序列P2:ATT CAG AAT GCC GAA CAC CG。

以提取的大腸埃希菌DNA為反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有PCR反應(yīng)體系均為25μL，其中2×Taq PCR MasterMix組成包括:0.1U／μL聚合酶，500mmol／L dNTP，20mmol／L Tris－HCl（pH 8.3），100mmol／L KCl，3mmol／L MgCl2等。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、紫外線檢測儀觀察結(jié)果，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行基因測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS13.0錄入建立數(shù)據(jù)庫并行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用χ2檢驗(yàn)。當(dāng)T＜1或N＜40時(shí)用確切概率法計(jì)算P值；若1≤T＜5且N≥40時(shí)用連續(xù)校正法處理。

2 結(jié) 果

2.1 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 71株臨床分離的大腸埃希菌對6種抗生素耐藥情況分別為:左氧氟沙星45株、環(huán)丙沙星51株、頭孢噻肟44株、頭孢西丁9株、鏈霉素41株、阿米卡星6株。其中耐藥率最高為環(huán)丙沙星72.86%，最低為阿米卡星8.57%。不同耐藥模式中以耐多藥最多為45株（64.29%），全敏最少為7株（9.86%）。

2.2 ESBLs鑒定結(jié)果 產(chǎn)ESBLs酶表型篩選試驗(yàn)初步篩出55株（77.46%），可疑產(chǎn)ESBLs菌株。通過進(jìn)一步確認(rèn)試驗(yàn)在58株疑產(chǎn)ESBLs菌株中共檢出產(chǎn)ESBLs菌35株（49.30%）。

2.3 大腸埃希菌中整合子遺傳標(biāo)記基因的PCR法檢測情況

2.3.1 整合子遺傳標(biāo)記在不同耐藥模式中檢出結(jié)果見表1。

表1 各種耐藥模式中整合子遺傳標(biāo)記基因陽性率比較

2.3.2 整合子遺傳標(biāo)志在產(chǎn)ESBLs酶菌株中檢出結(jié)果 見表2。

表2 產(chǎn)ESBLs酶大腸埃希菌不同耐藥模式中整合子遺傳標(biāo)記檢出情況

2.3.3 整合子遺傳標(biāo)記在非產(chǎn)ESBLs酶大腸埃希菌中檢出結(jié)果 見表3。

表3 非產(chǎn)ESBLs酶菌株不同耐藥模式中整合子遺傳標(biāo)記基因陽性率的比較

2.4 整合子遺傳標(biāo)記qacE△sul1電泳圖片和基因測序結(jié)果

將本實(shí)驗(yàn)中Ⅰ類整合子遺傳標(biāo)記（qacE△sul1）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列測序后的基因在BLAST上進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)與基因庫中已登陸的基因相同，整合子遺傳標(biāo)記qacE△sul1電泳圖見圖1。

圖1 整合子遺傳標(biāo)記qacE△sul1電泳圖

3 討 論

本研究中菌株對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、鏈霉素耐藥情況嚴(yán)重，尤其是在多耐藥模式中更為突出，以CTX＋LVE／CIP＋S模式常見。但對頭孢西丁和阿米卡星仍有較高的敏感性，這與頭孢西丁對β－內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定，阿米卡星對氨基糖苷類鈍化酶穩(wěn)定的抗菌作用特點(diǎn)有關(guān)。

大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs在不同國家的檢出有明顯差異，如土耳其大腸埃希菌的ESBLs發(fā)生率僅為12%［3］；而國內(nèi)近5年大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs菌株檢出率從46.0% 上升至63.4%，呈逐年增高的趨勢［5］。CTX－M（以高度水解頭孢噻肟為特征已dn為國內(nèi)外流行最廣的ESBLs［6］）。本研究中大腸埃希菌ESBLs檢出率為49.30%（36株），與文獻(xiàn)所報(bào)道基本一致。

基因盒－整合子系統(tǒng)多見于革蘭陰性桿菌，以腸桿菌、銅綠假單胞菌為主，是細(xì)菌尤其是革蘭陰性菌多重耐藥快速發(fā)展的重要原因［7］。依據(jù)整合酶基因序列的不同，將整合子分為6類，亦有文獻(xiàn)報(bào)道為8類［8］，目前報(bào)道較多的僅有4類。Ⅰ～Ⅲ類整合子已被證明與細(xì)菌耐藥性有關(guān)，為耐藥整合子，其中第Ⅰ、Ⅱ類整合子是最常見捕獲和表達(dá)耐藥基因的整合子［9］。近年來，國外大量文獻(xiàn)報(bào)道整合子可介導(dǎo)病原體各種藥基因獲得整合子病原菌可表現(xiàn)為多藥耐藥［10－13］。QacE△1－sul1是Ⅰ類整合子的遺傳標(biāo)記，實(shí)質(zhì)是qacE△1基因和sul1基因組成的重疊基因，位于Ⅰ類整合子3′保守區(qū)。Dahmen等［14］研究提示:6種不同腸桿菌中I類整合子基因具有較高的檢出率，整合子遺傳標(biāo)記以sul1常見，sul1和sul2的重疊顯現(xiàn)明顯。有學(xué)者對血培養(yǎng)中的大腸埃希菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，幾乎有一半菌株中整合子及Sul基因陽性，其中以經(jīng)典類整合子qacE△1－sul1最多。

本研究結(jié)果提示，Ⅰ類整合子在大腸埃希菌中有高的檢出率（78.57%），與文獻(xiàn)報(bào)道相近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs酶且整合子陽性者，出現(xiàn)耐藥概率比單純攜帶整合子或者產(chǎn)ESBLs酶的菌株要大，尤其在多耐藥模式中更為明顯。

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