鵝細小病毒YBLJ株VP3基因的真核表達

張 穎，魯 承，趙文婧，陳海迪，高 旭

（延邊大學農學院動物醫學系，吉林延吉133000）

鵝細小病毒病是由鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的主要侵害4日齡～20日齡雛鵝的一種病毒性傳染病，該病病程短，傳染性強，病死率高，給養鵝業造成了嚴重的危害［1-3］。該病毒由我國學者方定一于1956年在江蘇揚州首次發現。研究發現VP3基因是GPV核衣殼的主要成分，約占總蛋白含量的80%，具有較高的保守性，能夠誘導機體產生中和抗體，是GPV的主要保護性抗原［4-5］。本研究擬以本課題組前期分離的延邊株（YBLJ）鵝細小病毒為毒株，克隆VP3基因和構建真核表達載體，并研究GPV的VP3基因在Vero細胞中表達情況，為進一步研制GPV的VP3基因核酸疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌種 GPV（YBLJ株）為本實驗室從延邊某養鵝場發生鵝細小病毒病的病死鵝脾臟中分離得到。大腸埃希菌JM109、pcDNA3.1（＋）菌株由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 LipofectamineTM 2000轉染試劑盒為Invitrogen公司產品；限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ，以及ExTaq酶、DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和反轉錄試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產品；小鼠抗GPV VP3蛋白單抗為本試驗室制備；FITC標記的兔抗小鼠IgG二抗為Abcam公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據已克隆的鵝細小病毒 YBLJ株 VP3基因序列 （GenBank：JN836326）［6］，利用Loligo 6.0軟件設計合成了一對引物，由上海英駿生物技術有限公司合成，擴增片段長度為1 605bp。序列如下：上游5′-ATAAGCTTGCCACCATGGCAGAGGGAGGAG-3′（HindⅢ）；下 游5′-CGGGCTCGAGTTACAGATTTTGAGTT-3′（XhoⅠ）。

1.2.2 PCR擴增及克隆 以提取的GPV基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應程序為：95℃5min；94℃40s，58℃45s，72℃1min 40s，進行30個循環；72℃10min。純化回收VP3基因片段，與克隆載體pMD-18T連接，轉化至JM109感受態細胞。將PCR及酶切鑒定正確的重組質粒送往上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。

1.2.3 重組表達質粒的pcDNA-VP3的構建及鑒定 將鑒定正確的克隆質粒pMD-VP3和pcDNA質粒經HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后，回收VP3片段和pcDNA載體進行連接，構建重組表達質粒pcDNA-VP3。經PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質粒送往上海英駿生物技術有限公司進行鑒定。

1.2.4 重組質粒的轉染 用雙無培養液對重組質粒pcDNA-VP3和LipofectamineTM 2000進行稀釋后，通過脂質體介導法轉染Vero細胞，具體方法參照說明書進行操作。

1.2.5 RT-PCR檢測 采用Trizol法提取細胞總RNA［7-8］，按照寶生物工程（大連）有限公司反轉錄試劑盒說明書將其反轉錄成cDNA，并進行PCR擴增。

1.2.6 間接免疫熒光試驗（IFA）檢測 收集轉染的Vero細胞，在載玻片上包被后進行冷丙酮固定，以小鼠抗GPV的VP3蛋白單抗為一抗，熒光素標記的兔抗小鼠IgG為二抗，進行IFA檢測，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 VP3基因的克隆及真核表達載體的構建

以提取的GPV基因組DNA作為模板進行PCR擴增，在約1 605bp處出現了與預期片段大小相符的特異性目的條帶（圖1）。對PCR鑒定為陽性的真核質粒pcDNA-VP3進行酶切鑒定得到約5 428bp和1 605bp的2個片段（圖2），表明重組質粒構建正確。同時測序結果也驗證了真核表達載體已成功構建。

圖1 VP3基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of VP3gene

圖2 重組質粒酶切鑒定結果Fig.2 Identification of recombinant plasmids by enzyme digestion

2.2 RT-PCR檢測

提取轉染重組質粒的Vero細胞培養物總RNA，進行RT-PCR擴增，在約1 605bp處有一個明顯的目的條帶（圖3）。

2.3 IFA檢測結果

在熒光顯微鏡下觀察到轉染重組質粒的Vero細胞中出現綠色熒光，未轉染質粒的Vero細胞未出現綠色熒光（圖4），表明VP3基因在Vero細胞中獲得表達。

圖3 RT-PCR檢測結果Fig.3 Result of RT-PCR amplification

圖4 表達產物的IFA檢測結果 （200×）Fig.4 IFA detection result of gene expression in Vero cells（200×）

3 討論

細小病毒（Parvovirus）分為自主復制型細小病毒和依賴型細小病毒，鵝細小病毒（GPV）屬于自主復制型細小病毒，復制過程不需要輔助性病毒存在，病毒為無囊膜單鏈DNA病毒。GPV主要侵害4日齡～20日齡雛鵝，病毒可垂直傳播，種鵝是主要的傳染源，通過種蛋使雛鵝感染，由于雛鵝免疫系統不健全，導致感染雛鵝大批死亡，有的死亡率高達100%，因此鵝細小病毒病又名小鵝瘟，嚴重危害養鵝業的健康發展［9-11］。目前，國內外GPV疫苗以傳統疫苗為主，但其存在著滅活不徹底、毒力返強和散毒等缺點，致使GPV在鵝群中長期存在，無法凈化，而核酸疫苗避免了以上諸多缺點。因此，研制GPV核酸疫苗仍是當務之急。

在GPV的3種結構蛋白（VP1、VP2和VP3）中，衣殼蛋白VP3是病毒的主要結構蛋白和病毒核衣殼的主要成分，暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激機體產生保護性中和抗體的重要抗原蛋白，所以VP3基因是研制 GPV 核 酸疫苗的首選基 因［1，5，12］。目前常用的真核表達載體有pVAX1、pcDNA3.1和pJW4304等，均含有CMV啟動子，能夠高水平的表達外源基因，其中pcDNA3.1質粒較小，易被細胞攝取，有助于維持mRNA的穩定性，利于在哺乳動物細胞中高水平表達重組蛋白。張建遠等［13］應用pcDNA載體構建的SARS冠狀病毒核酸疫苗和豬圓環病毒核酸疫苗免疫動物后，結果顯示所構建的核酸疫苗能誘導機體產生較好的免疫反應。因此，本試驗采用pcDNA作為真核表達載體，構建了pcDNA-VP3真核表達載體。在轉染方面采用操作簡單易行、可靠的脂質體介導法進行真核細胞轉染，通過LipofectamineTM 2000將真核表達質粒pcDNA-VP3轉染至Vero細胞中，結果表明在外源啟動子的起始下，重組質粒能夠在Vero細胞中穩定表達VP3基因，經IFA檢測證明表達的VP3蛋白具有反應活性，提示已成功構建了GPV VP3基因的真核表達載體。本試驗的研究結果為進一步研究GPV VP3基因在雛鵝體內的表達情況提供了理論依據，為研制GPV核酸疫苗奠定了基礎。

［1］ Yu T F，Ma B，Gao M C，et al.Localization of linear B-cell epitopes on goose parvovirus structural protein［J］.Vet Immunol Immunopathol，2012，145（1-2）：522-526.

［2］ Ju H，Wei N，Wang Q，et al.Goose parvovirus structural proteins expressed by recombinant baculoviruses self-assemble into virus-like particles with strong immunogenicity in goose［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，409（1）：131-136.

［3］ Yang J，Yang R，Cheng A，et al.A simple and rapid method for detection of goose parvovirus in the field by loop-mediated isothermal amplification［J］.Virol J，2010，21（7）：14.

［4］ Shien J H，Wang Y S，Chen C H，et al.Identification of sequence changes in live attenuated goose parvovirus vaccine strains developed in Asia and Europe［J］.Avian Pathol，2008，37（5）：499-505.

［5］ Zhang Y，Li Y，Liu M，et al.Development and evaluation of a VP3-ELISA for the detection of goose and Muscovy duck parvovirus antibodies［J］.J Virol Meth，2010，163（2）：405-409.

［6］ 高 旭，張 穎，魯 承.鵝細小病毒強毒YBLJ分離株的分離鑒定與vp3基因的進化分析［J］.中國預防獸醫學報，2011（12）：121-124.

［7］ Ji J，Xie Q M，Chen C Y，et al.Molecular detection of Muscovy duck parvovirus by loop-mediated isothermal amplification assay［J］.Poult Sci，2010，89（3）：477-483.

［8］ 薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南［M］.北京：科學出版社，2002.

［9］ Zhu L Q，Ding X Y，Tao J，et al.Identification of target cells for Goose parvovirus infection in the immune system organs［J］.Acta Virol，2010，54（3）：211-215.

［10］ Lee J W，Lin Y M，Yen T Y，et al.CpG oligodeoxynucleotides containing GACGTT motifs enhance the immune responses elicited by agoose parvovirus vaccine in ducks［J］.Vaccine，2010，28（50）：7956-7962.

［11］ Qiu Z，Tian W，Yu T，et al.Monoclonal antibodies against NS1protein of goose parvovirus［J］.Hybridoma，2012，31（2）：125-130.

［12］ Palya V，Zolnai A，Benyeda Z，et al.Short beak and dwarfism syndrome of mule duck is caused by a distinct lineage of goose parvovirus［J］.Avian Pathol，2009，38（2）：175-180.

［13］ 張建遠，王紅寧，陳錦銳.豬圓環病毒核酸疫苗pcDNAPCV-ORF2-ISS的構建及分子佐劑聯合免疫研［J］.2009（12）：1511-1515.