禽流感病毒RT－LAMP檢測技術的建立

彭 宜，謝芝勛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝志勤，謝麗基，范 晴，羅思思

（廣西獸醫研究所廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西南寧530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的禽流行性感冒的簡稱［1］。根據AIV表面糖蛋白血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）抗原性不同，AIV可分為16個HA亞型和10個NA亞型［2－3］。禽流感據其臨床癥狀又可分為高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（Mildly pathogenic avian influenza，MPAI）。HPAI由H5、H7亞型AIV引起，以高發病率和高病死率為特征。MPAI可由所有的HA亞型（H1－H16）AIV引起，通常引起較溫和的臨床癥狀［4－5］。隨著 H5、H7亞型 HPAI的暴發，MPAI沒有引起人們足夠的重視，直到1999年香港H9N2亞型禽流感病毒感染人的事件才引起世界對MPAI的關注。有關研究還表明1997年香港人源H5N1亞型 AIV 與 A／Teal／HK／W 312／97（H6N1）有7個基因片段高度同源［6－7］。越來越多的研究表明家禽中的低致病性禽流感病毒（MPAIV）可以通過基因重排為感染人類的流感病毒提供基因或直接突破種間屏障感染人［8－12］。禽流感不僅給養殖業帶來巨大經濟損失，而且嚴重威脅人類健康，因此有必要利用快速簡便特異的檢測技術加強AIV的病原學監測工作。

環介導等溫擴增技術（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是近年來發展起來的在等溫條件下進行的新型核酸擴增反應，該技術具有靈敏、特異、結果便于觀察等優點而被廣泛應用于各種病原微生物的檢測［13－19］。本研究設計了針對AIV M基因的特異性LAMP引物，并優化相關反應條件，建立的 AIV 逆轉錄－環介導等溫擴增 （RTLAMP）檢測技術靈敏、特異，并實現了反應結束即可用肉眼直接對結果進行可視化判定，整個反應操作簡便、快速、成本低廉，尤其適合在基層進行AI的早期診斷和大規模篩查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 H1、H3、H4、H6、H9、H11亞型 AIV由廣西獸醫研究所生物技術研究室分離鑒定，其他亞型禽流感病毒RNA為美國康州大學 Mazhar I Khan教授惠贈；新城疫病毒（NDV）F48、傳染性支氣管炎病毒（IBV）M41、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）北京株及雞毒支原體（MG）S6由廣西獸醫研究所生物技術研究室保存提供。

1.1.2 主要試劑 Bst DNA聚合酶（大片段）、Mg－SO4、Betaine為 New England Biolabs公司產品；MMLV逆轉錄酶、d NTP為MBI公司產品；熒光染料為International Laboratory公司產品；SPF雞胚購自北京梅里亞公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA 及 DNA 的抽提根據 Axy PrepTMBody Fluid Viral DNA／RNA Miniprep Kit（愛思進公司）說明書制備樣品DNA／RNA，置－70℃保存備用。

1.2.2 引物的設計與合成 利用Lasergene軟件對大量不同HA亞型AIV的M基因序列進行比對，運用在線軟件Primer Explorer V4在M基因的保守區設計3套LAMP引物。每套LAMP引物包括1對外引物、1對內引物和1對環引物，其中F3和B3為外引物，FIP（F1c＋F2）和BIP（B1c＋B2）為內引物，LF和LB為環引物。引物由廣州Invitrogen公司合成。通過3次以上重復試驗，確定特異性和敏感性最好的一套引物（表1）。

表1 RT－LAMP引物序列Table1 Sequences of RT－LAMP primers

1.2.3 RT－LAMP反應體系的優化 將影響RTLAMP擴增效率的反應成分包括MgSO4、Betaine、Bst DNA Po Lymerase、d NTP和反應條件（時間、溫度）在如下濃度和條件范圍內進行優化：MgSO4（0.6、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mmol／L），Betaine（0.2、0.5、0.8、1、1.2、1.5、1.9 mmol／L），Bst DNA Po L－ymerase（4 、5 、6 、7 、8、9 、10 、12、14U），d NTP（0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6 mmol／L）。將溫度按59、60、61、62、63、64℃依次遞增，反應時間為30、45、60 min。多次重復試驗后確定最佳反應條件和反應試劑的最佳濃度。

1.2.4 靈敏度試驗 使用 Beckman DU－800紫外分光光度計測定總RNA含量，制備含量分別為1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg的禽流感病毒總RNA模板，對各含量禽流感病毒總RNA用RT－LAMP方法和一步RT－PCR方法同時進行擴增，RT－PCR擴增引物為F3和B3，RT－LAMP反應產物直接可視化觀察，RT－PCR擴增產物10 g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.2.5 特異性試驗 以不同亞型AIV及NDV、IBV、ILTV、MG核酸為待檢樣品利用優化好的RT－LAMP反應體系進行檢測，對RT－LAMP方法的特異性進行檢驗。

1.2.6 RT－LAMP反應結果的觀察 RT－LAMP反應之前將熒光試劑（Calcein和MnCl2的混合液）加入反應體系中，反應結束后可在可見光或紫外線下根據反應液的顏色變化用肉眼對結果直接進行判定。也可取5μL產物經15 g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.2.7 臨床樣品的檢測 應用建立的 AIV－RTLAMP方法對活禽市場家禽泄殖腔棉拭子樣品及感染雞、健康雞臟器組織研磨混合液共計200份樣品進行檢測，所有樣品同時用經典的雞胚接種病毒分離方法、傳統的RT－PCR方法進行檢測，檢驗AIV－RT－LAMP方法的可靠性。

2 結果

2.1 RT－LAMP反應體系的優化和結果觀察

RT－LAMP反應總體系為25μL，優化后的反應體系詳見表2。在63℃水浴鍋或金屬恒溫槽中，反應45 min，80℃作用5 min終止反應。反應產物經15 g／L瓊脂糖凝膠電泳后，陽性產物可出現LAMP反應所特有的特征性條帶（圖1）。同時反應結束后，不需打開反應蓋，即可直接可見陽性反應液顏色由反應前的淺桔色變為淺綠色、紫外光下可發綠色熒光（圖2 A和圖2 B）。

表2 RT－LAMP反應體系Table2 The reaction system of RT－LAMP assay

2.2 特異性試驗結果

如表3所示，建立的RT－LAMP方法能特異性的檢測所有亞型AIV，而對其他呼吸道病原體呈陰性反應。

2.3 靈敏度檢驗

如圖2所示 RT－LAMP方法對禽流感病毒RNA的最小檢測限為10 fg，靈敏度是RT－PCR的1 000倍。

2.4 臨床樣品檢測

如表4所示，200份臨床樣品用RT－LAMP方法檢測到23份AIV，結果與病毒分離結果相符，而常規RT－PCR方法漏檢了2份棉拭子樣品。

圖1 RT－LAMP反應產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.1 Products of RT－LAMP assay confirmed by agarose gel electrophoresis

圖2 RT－LAMP和RT－PCR檢測AIV的靈敏度比較Fig.2 Comparative sensitivity tests between RT－LAMP and RT－PCR assays for detection of AIV

表3 RT－LAMP特異性檢測結果Table3 Specificity results of RT－LAMP assay

表4 臨床樣品檢測結果Table4 Detection results of clinic samples by virus isolation，RT－PCR，RT－LAMP

3 討論

AIV為RNA病毒，由于RNA依賴的RNA聚合酶缺乏矯正功能，所以RNA病毒的突變率比DNA病毒高，在宿主防御機制選擇壓力下，AIV的表面抗原基因發生點突變而引起抗原漂移［20］，另外AIV有多種亞型，且基因組為分8個節段，當不同亞型AIV感染同一細胞時，病毒基因組可通過互換基因發生基因重排而引起抗原轉變［21］。水禽是AIV的儲存庫，眾多亞型AIV都能從水禽體內分離到，且同時感染不同亞型AIV的現象比較普遍，這就為基因重排創造了有利條件，易于產生引起人類流感大流行的新流行株，可見加強AIV監測的重要性。近年來時有發生AIV跨越宿主屏障直接感染人并引起人死亡的事件，提示禽流感不再只是養殖業的威脅，更嚴重威脅到人類的健康，發展快速、準確的AIV檢測技術對禽流感及人禽流感防控尤為重要。

LAMP反應是通過一套識別靶序列上8個特異區域的引物和具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下迅速進行的核酸擴增反應，整個反應不需要特殊的儀器設備，僅在水浴鍋中30 min～60 min即可完成［22］。本研究通過比較基因庫里大量AIV－M基因序列，設計了多套特異的LAMP引物，通過多次重復試驗，篩選出一套特異性和敏感性最好的LAMP引物，并優化反應條件和體系，建立的RT－LAMP技術能特異的檢測所有亞型AIV而對其他家禽呼吸道病原微生物呈陰性反應，靈敏度是常規RT－PCR方法的1 000倍，臨床樣品的檢出率與經典的雞胚病毒分離方法相符。本研究還在反應之前加入熒光試劑（Calcein和MnCl2的混合液），反應結束后可通過肉眼在可見光或紫外線下直接觀察反應液的顏色變化來判定結果［23］，既避免了因反應結束后開蓋加熒光染料時污染環境而造成假陽性結果的發生，同時又實現了反應結果的可視化觀察。

本研究建立的AIV RT－LAMP可視化檢測技術快速、簡便、靈敏、特異且成本低廉，尤其適合在儀器設備簡單、技術人員缺乏的基層用該技術進行禽流感的早期快速診斷和篩查。

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