山羊美麗筒線蟲ITS序列的PCR擴增及分析

王亞男，宋軍科，趙光輝，邊青青，于三科

（西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌712100）

寄生于宿主食道黏膜下的美麗筒線蟲（Gongylonema pulchrum）是一種細線狀、乳白色的線蟲，屬于旋尾目筒線科，呈世界性分布［1］。其宿主范圍十分廣泛，以包括靈長類在內的多種哺乳動物為終末宿主，如牛、綿羊、山羊、駱駝、豬、馬、鹿、熊、嚙齒類動物等［2-5］，以金龜子和蟑螂為其中間宿主［6］，偶爾可在人體寄生，人體寄生的最早病例是由Leidy［7］在美國費城發現的。此后世界各地陸續有散在的病例報道。中國自1955年在河南發現第1例病人后，迄今已報道百余例，分布于山東、黑龍江、遼寧、內蒙古、甘肅、陜西、青海、四川、北京、河北、天津、河南、山西、上海、江蘇、湖北、湖南、福建、廣西等19個?。ㄊ?、區），其中山東報告的病例最多［8-13］。人感染美麗筒線蟲后常表現精神癥狀如妄想癥等［14］，動物感染造成動物漸進性消瘦，影響其生產性能。

美麗筒線蟲形態學鑒定較為困難，常因需要專家等不能普及應用，需要一種更為準確、方便、普及的檢查方法。核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列有著顯著的株間差異，可揭示種間甚至種內多態性，已被廣泛用于寄生蟲分子學鑒定和變異分析。

本研究對采自陜西神木的美麗筒線蟲進行ITS的PCR擴增、克隆、測序及序列分析，以期為美麗筒線蟲的分子鑒定提供基礎資料［15-17］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體 采自陜西省榆林市神木縣山羊食道分離出的食道寄生蟲，經過初步形態學鑒定為美麗筒線蟲［6］，樣品代碼為 G.P，在750mL／L酒精中保存，用于提取DNA。

1.1.2 試劑盒與載體 DNA提取試劑盒（康為世紀）、DNA膠回收試劑盒（康為世紀）、pMD19-T載體（TaKaRa公司）。

1.1.3 引物 上游引物NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′；下游引物 NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′；由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 蟲體DNA的提取 從-20℃酒精保存液中取出單個蟲體，置于新鮮滅菌過的平皿中，用蒸餾水清洗5次，剪碎，置于1.5mL離心管中，加入180μL buffer GTL，用研磨棒充分研磨30min，然后加入20μL蛋白酶K，漩渦震蕩使其徹底混勻，置于56℃水浴鍋中過夜消化，次日按照康為世紀DNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 PCR擴增 PCR反應體系為25μL，包括雙蒸水17μL，10×buffer 2.5μL，Mg2＋3μL，DNTP 2μL，上游引物（NC5）／下游引物（NC2）各0.25μL，rTaqDNA聚合酶0.25μL，模板DNA各2μL，加入各物質后，混勻，于手掌離心機上瞬時離心，設空白對照，置PCR儀上擴增。PCR擴增程序為：94℃5min；94℃2min，45℃45s，72℃2min，35個循環；72℃延伸10min。PCR產物在含溴化乙錠（EB）的10g／L瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下觀察擴增結果。

1.2.3 目的DNA片段的回收與連接 將電泳驗證的已擴增成功的PCR產物全部點樣于含溴化乙錠（EB）的10g／L瓊脂糖凝膠上再次電泳，切下含有目的條帶的瓊脂快，用DNA膠回收試劑盒進行回收，取4μL膠回收產物與1μL pMD19-T Vector和5μL SolutionⅠ在16℃下過夜連接。

1.2.4 轉化與克隆 分裝感受態細胞，每管25 μL，取10μL連接物與感受態細胞混勻，置于冰水混合物上30min后，置于42℃水浴鍋中2min，輕輕取出，冰上放置3min。每一管加入800μL培養基，放入搖床2h，之后取出6 000r／min離心5min。將管中上層液體去除，留100μL左右搖勻，均勻涂抹于氨芐平板上，過夜培養。然后挑取單個菌落5個分別接種于1mL含Amp＋1.5μL的LB液體培養基中，于37℃以220r／min搖振培養7h。

1.2.5 測序與分析 挑選G.P樣品中鑒定為陽性的克隆送上海生工生物工程技術服務公司測序，然后將測序結果用DNA Star軟件進行序列分析和比較。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

將PCR產物于10g／L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，獲得了長度均為900bp的片段，與預期的擴增片段長度相符，且特異性和重復性好（圖1）。

2.2 克隆、轉化及菌液PCR

用DNA膠回收試劑盒回樣品G.P3的PCR產物并將之克隆到pMD19-T載體，然后轉化至感受態細胞并進行菌液PCR鑒定，代碼為G.PC1、G.PC2、G.PC3、G.PC4、G.PC5。將菌液PCR擴增產物于10g／L瓊脂糖凝膠進行電泳，可見大小約為900bp，與預期目的片段大小一致的條帶（圖2）。

圖1 美麗筒線蟲ITS序列的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of ITS rDNA of G.P

圖2 美麗筒線蟲ITS序列菌液PCR鑒定Fig.2 PCR Identification of G.P ITS sequence bacterium fluid

2.3 序列鑒定與分析

2.3.1 序列鑒定 將篩選出的3個陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，獲得了核苷酸序列。經GenBankTM中G.pulchrum標準序列比較鑒定，確認為ITS序列。長度為1 035bp，3個序列完全一致。

2.3.2 序列分析 將此序列分別與GenBankTM中收錄的美麗筒線蟲日本鹿分離株（B513721.1）代碼為d.j、伊朗肉牛分離株（AB495392.1）代碼為c.i及日本牛和野生動物分離株（AB646060.1）代碼為c.j的參考序列進行比對（圖3），結果表明，美麗筒線蟲分離株與3個參考株的相似性介于98.1%～99.7%之間，與伊朗肉牛和日本鹿分離株相似性最高，為99.7%。ITS2、5.8S序列與參考株相似性均達到100%（圖4～圖6），其中“d.j”為 NCBI中注冊的G.pulchrumITS序列，注冊號AB513721.1；“c.j”為NCBI中注冊的G.pulchrumITS序列，注冊號 AB646060.1；“c.i”為 NCBI中注冊的G.pulchrumITS序列，注冊號AB495392.1。

圖3 G.P ITS序列與GenBankTM公布的美麗筒線蟲ITS序列比較Fig.3 The comparison of ITS sequences of G.P with those available in GenBankTM

圖4 G.P ITS1序列與GenBankTM公布的美麗筒線蟲ITS1序列相似性比較Fig.4 Similarity comparison of ITS1sequences of G.P with those available in GenBankTM

圖5 G.P 5.8S序列與GenBankTM公布的美麗筒線蟲5.8S序列相似性比較Fig.5 Similarity comparison of 5.8Ssequences of G.P with those available in GenBankTM

圖6 G.P ITS2序列與GenBankTM公布的美麗筒線蟲ITS2序列相似性比較Fig.6 Similarity comparison of ITS2sequences of G.P with those available in GenBankTM

3 討論

rDNA序列因其功能上的高度保守性和進化的時鐘性，已被越來越多地用于物種分類和遺傳進化關系的研究，尤其是種間分類研究［18］。ITS序列是rDNA中介于18S和28S之間的內轉錄間隔區，包含核糖體第一內轉錄間隔區ITS1和核糖體第二內轉錄間隔區ITS2兩段序列，有時也將ITS1，5.8S rRNA和ITS2統稱為ITS區。由于ITS序列進化速度快，具有種內變異小而種間變異大的特性，是種類鑒定和系統發育分析的重要分子標記［18-19］。以ITS為遺傳標記，進行PCR擴增與序列比較已成功地應用于多種寄生蟲的分子鑒定和分類［20］。

本研究中選用的分離株是從神木的山羊中分離得到的。對其ITS序列的擴增與序列分析，結果顯示美麗筒線蟲分離株ITS1與參考株的相似性為98.1%～99.7%，ITS2、5.8S序列與參考株相似性達到100%。美麗筒線蟲可感染人，在臨床上沒有特征性的癥狀和診斷方法，目前對其的分子學研究比較少見，尤其是羊分離株。本研究報道了山羊美麗筒線蟲的ITS序列，對其分離株的基因組序列變化進行分析，有助于了解美麗筒線蟲的致病特性和變異情況，為美麗筒線蟲的分子生物學的進一步研究奠定了基礎。

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