抗球蟲新藥納川珠利在大鼠肝S9中的代謝穩定性研究

李素梅，張可煜，王霄旸，李 濤，薛飛群

（中國農業科學院上海獸醫研究所 農業部動物寄生蟲學重點開放實驗室 中國農業科學院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室，上海200241）

球蟲病是雞、火雞、兔等畜禽的常見寄生蟲，每年給養雞業、養兔業造成巨大損失，三嗪類抗球蟲藥是當前預防和治療球蟲病較有效的藥物［1］。然而，地克珠利（diclazuril）和妥曲珠利（toltrazuril）等藥物由于長期使用，已經導致非常嚴重的耐藥性問題［2-3］。納川珠利是新型的三嗪類抗球蟲藥物，已有報道顯示該藥不僅具有良好的抗球蟲效果，抗球蟲指數（ACI）達185～200［4］，與地克珠利、妥曲珠利等其他三嗪類化合物無交叉耐藥性，且安全性好、毒副作用低，具有廣闊的應用前景。作為國家一類新獸藥開發的納川珠利的代謝特征目前尚無相關研究報道。

肝臟是機體進行生物轉化的主要場所，以肝臟為基礎的體外代謝模型在藥物代謝中應用廣泛，其與體內代謝相比具有以下優點：①體外代謝可以排除體內諸多的干擾因素，直接觀察代謝酶對底物的選擇性代謝，為體內代謝的研究提供重要線索。②體外代謝具有快速簡便的特點，適合大量化合物的藥動學篩選。③試驗過程中，無需消耗大量的樣品和試驗動物，降低了研究費用［5］。

研究藥物體外代謝的方法主要有肝微粒體孵育法、肝細胞系孵育法、肝S9孵育法、原代肝細胞孵育法等。肝微粒體法因操作簡易得到廣泛應用，但其缺乏除CYP450及UGTs以外的其他代謝酶，可能導致某些代謝物的丟失；肝細胞系容易培養，但此類細胞不表達或僅少量表達相關代謝酶，這大大的限制了該系統的應用；原代肝細胞系統克服了代謝酶表達量少的問題，然而制備過程復雜，在初步篩選中較少運用。肝S9系統制備簡便，且該系統所含的酶比肝微粒體更豐富，適合對藥物體外代謝進行初步篩選［6］。本研究利用高效液相方法研究了納川珠利與大鼠肝S9孵育的代謝穩定性及可能存在的代謝物［7-13］，為進一步研究納川珠利在體內的消除規律、確證代謝產物和指導臨床合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Waters 2690高效液相色譜儀，Waters 2487檢測器，Thermo高速離心機，渦旋振蕩混合器，上海凌初環保儀器有限公司生產；超純水系統，上海瑞楓生物科技有限公司生產。

1.1.2 試劑 納川珠利對照品（含量99.81%，批號20101210）為中國農業科學院上海獸醫研究所動物藥學研究室制，大鼠肝S9為Biology Toxicity產品，6-磷酸葡萄糖（G-6-P），6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）輔酶Ⅱ（NADP）為Roche產品，色譜純乙腈為Fisher產品，其他試劑均為分析純。

1.1.3 對照品儲備液和工作液的配制 精密稱取納川珠利對照品20mg，置于10mL容量瓶中以二甲基亞砜 （DMSO）溶解稀釋至刻度，制成2mg／mL的對照品儲備液。精確量取1mL儲備液于10mL容量瓶中，以pH 7.5濃度為0.1mol／L的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，得0.2mg／mL的工作液。

1.2 方法

1.2.1 孵育條件 試驗組反應體系中肝S9蛋白濃度為2mg／mL，其中NADPH還原系統各組分含量如下：1mmol／L NADP、10mmol／L 6-磷酸葡萄糖、2U／mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、7mmol／L MgCl2。該反應體系放入37℃水溫箱，預孵育5min后，加入納川珠利工作液50μL，反應體系終體積為0.5mL。對照組于反應體系預孵育5min后加入50μL 0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），其他均與試驗組相同。取不同孵育時間的樣品加入2倍體積的乙腈，混合渦旋終止反應。4℃、5 000r／min離心15min，取上清液經0.22μm微孔濾膜過濾后進樣分析。

1.2.2 色譜條件 Dikma（2.0mm×150mm，5μm）C18色譜柱；柱溫30℃；流動相為乙腈︰1 mL／L甲酸水=50︰50；流速為1mL／min；檢測波長為300nm，進樣量15μL。

1.2.3 方法專屬性 按1.2.1處理方法，1.2.2色譜條件考察對照組與試驗組在試驗條件下的色譜行為，考察該方法的專屬性。

1.2.4 納川珠利溶液的穩定性 取50μL納川珠利工作液加入450μL磷酸鹽緩沖液中，置于37℃溫箱48h后 ，加入1 000μL乙腈，混勻后經0.22μm微孔濾膜過濾后進樣分析，考察納川珠利在37℃下的穩定性。

1.2.5 工作曲線的制備 精密量取納川珠利工作液，置于37℃ 預孵育5min后的大鼠肝S9反應體系中，配制成分別含0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg／mL納川珠利的系列樣品，終體積為0.5mL，立即加入1mL乙腈混合，4℃、5 000r／min離心15 min，上清液經0.22μm微孔濾膜過濾后上樣分析。以納川珠利峰面積（Y）對其濃度（X）進行線性回歸。

1.2.6 最低檢測限 按照1.2.5分別配制并處理0.1、0.2、0.5mg／mL系列樣品，1.2.2色譜條件考察最低檢測限，即當S／N=3時的樣品濃度。

1.2.7 回收率及精密度測定 選取0.5、2.0、20.0 μg／mL為高、中、低3個濃度為質控樣品，按照1.2.5處理后進樣，求方法回收率。分別按照測定方法每個濃度平行測定5個樣品；并連續重復3d，計算日間日內精密度。

1.2.8 納川珠利在大鼠肝S9的代謝穩定性 取0、0.5、1.0、2.5h時的孵育液，每個時間點設3個樣品，每個樣品測量3次，代入工作曲線回歸方程，計算孵育液中納川珠利的濃度。

2 結果

2.1 方法專屬性

對照組與試驗組色譜圖顯示納川珠利的出峰時間為10.9min（圖1B中2），且分離度良好，對納川珠利的專屬性好。同時，與對照組相比較，試驗組色譜圖監測到代謝產物1，其出峰時間為2.4min（圖1B中1）

圖1 對照組與試驗組色譜圖Fig.1 Chromatogram of the control group and the experimental group

2.2 納川珠利溶液的穩定性

納川珠利溶液置于37℃溫箱48h后，按1.2.2測定納川珠利的峰面積變化小于0.7%，結果顯示藥物在孵育環境中穩定。

2.3 工作曲線與最低檢測限

納川珠利峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，得到納川珠利在S9孵育體系中的線性方程為Y=48 529X＋403.95R2=1.000，線性范圍為0.5 μg／mL～20.0μg／mL，最低檢測限為0.1μg／mL。

2.4 回收率及精密度

高、中、低3個濃度，每個濃度平行測定5個樣品，并3d內重復3次的回收率及精密度如表1。結果顯示其回收率在96%～101%之間，日內精密度低于2.3%，日間精密度低于5.6%，回收率及精密度良好，符合生物樣品的測定要求。

表1 納川珠利回收率及精密度試驗結果（n=5）Table 1 The results of recovery and precision of natromezuril（n=5）

2.5 納川珠利在大鼠肝S9的代謝穩定性

納川珠利與大鼠肝S9孵育2.5h后約代謝了42%。0～1h內藥物濃度從20.03μg／mL（C0）線性下降到15.07μg／mL（C），代謝符合一級反應的特征（圖2）。以lnC／C0-t作線性回歸，消除公式為：lnC／C0=-1.842t＋7.264，R2=0.999 5，由公式K.t=lnC0／C；t1／2=ln2／K進一步計算可得反應速率常數K=0.004 719min-1，t1／2=146.88min。與納川珠利的代謝消除對應的是0h～1h內代謝產物1亦呈線性增加，進一步利用色譜峰面積進行比較，發現代謝產物1的峰面積為納川珠利孵育前后峰面積差的36%（圖3）。

圖2 納川珠利在大鼠肝S9中代謝消除趨勢Fig.2 Metabolic elimination tendency of natromezuril in hepatic S9

圖3 納川珠利代謝物的時間-峰面積圖Fig.3 Time-peak area graph of the metabolite of natromezuril

3 討論

本研究成功建立了大鼠肝S9孵育液中納川珠利含量的檢測方法，方法回收率高，高、中、低3個質控濃度下的回收率均大于90%，日內和日間精密度良好，符合生物樣品的測定要求。

考慮到孵育時間過長，一方面會影響酶的活力，導致反應結果不具分析性；另一方面會導致樣品變質，使得制備的工作曲線方程不適用于含量分析。因此本研究選取2.5h為孵育時間，發現0～1h范圍內納川珠利在大鼠肝S9孵育液中呈線性消除，符合一級反應的特征，反應速率常數K=0.004 719 min-1，t1／2=146.88min，表明該代謝系統對納川珠利具有較弱的代謝能力，納川珠利具有較高的代謝穩定性。本研究同時還監測到納川珠利代謝產物1，其在0～1h內隨納川珠利濃度的下降而呈線性增加，約占納川珠利藥物代謝總量的36%。

本研究初步確定了納川珠利在大鼠肝S9系統中具有較高的代謝穩定性，并監測到可能存在的代謝產物，為進一步鑒定納川珠利的代謝產物及結構，研究納川珠利在體內外的代謝和消除規律提供了科學依據。

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