抗浪魚的核型研究

孔令富，畢保良，李蓮軍，汪 霞，王俊相，吳志蕾，李永能，李 潔

（云南農業大學動物科學技術學院，云南昆明650201）

抗浪魚（Anabarilius grahami）原產于中國第二深高原淡水湖云南省撫仙湖，隸屬硬骨魚綱（Actinopterygii），鯉 形 目 （Cypriniformes），鯉 科 （Cyprinidae），鲌亞科（Cultrinae）白魚屬（Anabarilius）。抗浪魚是一種珍稀地方魚種，20世紀90年代以后，由于過度捕撈及銀魚的引進放養，撫仙湖抗浪魚的產量逐年下降，瀕臨滅絕。目前，關于抗浪魚的研究主要是對其生物學特性的描述，包括形態特征、生活習性、生長特點、繁殖習性的描述和瀕危原因的分析及對策。目前，除了對抗浪魚線粒體DNA和遺傳多樣性有部分研究［1］外，對抗浪魚的染色體的研究報道較少。

染色體是魚類遺傳的物質基礎［2-3］，其數目和形態結構具有該物種的特征，一定程度上也反映了生物進化的歷史［4］，在魚類的遺傳變異中，染色體起著重要的作用，對魚類染體數量、形態與結構的研究，在遺傳學中的基因定位、雜交以及多倍體育種等領域起著重要的作用［5-6］。核型是指把動物、植物、真菌等的某一種有機體或某一分類群的體細胞內整套染色體拍攝下來，按照它們相對恒定特征排列起來的圖象。對核型作比較分析主要是確定它們之間在核型上的相同或不同特征，即核型的同源性和異源性，核型的共同特征常是鑒定不同物種或分類群之間近緣關系的重要依據，而對核型異質性的探究是區分不同分類群的重要依據。核型特征主要有染色體二倍數（2n）、染色體分組組成或稱核型公式、染色體的臂數、染色體相對長度、臂比，次縊痕的數量等等。魚類的染色體較小，數目偏多，研究工作難度較大，進展較為緩慢，截止2005年，已報道染色體核型的魚類有2 100種左右，約占總數10%，且大多數為淡水魚類，集中在鯉形目、鯰形目、鱸形目上。近年來，對鯉科魚類染色體研究比較多，發現染色體數2n=100廣泛存在于鯉科魚類中，但核型卻各不相同。本研究目的在于通過對抗浪魚染色體組型的研究，為該魚種質的細胞遺傳學檢測提供相應的參數，為抗浪魚的系統演化、進化地位的確定提供基礎資料，同時為抗浪魚的選育種工作提供細胞生物學、細胞遺傳學方面的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

成年健康抗浪魚8條，購自云南漫灣有限責任公司水產養殖場；甲醇、冰醋酸、KCl、生理鹽水、Giemsa染色原液、植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）和秋水仙素（colchicine）為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 魚腎細胞懸液的制備、低滲處理及固定PHA經小牛血清溶解后按10μg／g體重胸腔注射抗浪魚，14h后按1μg／g體重注射秋水仙素，3h后放血取腎，于8g／L的生理鹽水中清洗2遍～3遍，然后置于含少量生理鹽水的培養皿中，充分剪碎后加入適量生理鹽水，用吸管吹打數分鐘，即可獲得魚腎細胞懸液。取魚腎細胞懸液800r／min離心7min后，收集細胞，吹勻后加入預熱的0.075mol／L KCl溶液，37℃低滲處理30min～60min。經低滲后的細胞吹勻后加固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定30min，離心800r／min離心10min，重復固定2次。

1.2.2 滴片 將魚腎細胞懸液滴于預冷（4℃冰箱中預冷）載玻片上，每片1滴～2滴，自然干燥。染色待片干后，用100mL／L Giemsa液（pH 6.8，磷酸緩沖液配制）染色60min，用水充分沖洗，自然干燥后封片。1.2.3 染色體的觀察與計數 選取100個不同個體的魚腎細胞，經顯微鏡進行觀察統計，確定染色體2n數目。在油鏡下觀察計數100個中期分裂相，在確定抗浪魚為二倍體的基礎上，選取10個左右進行拍照、測量。

1.2.4 核型分析 首先目測照片上每條染色體長度，按長短順序初步編號，寫在每條染色體短臂的一端，同時確定主縊痕的位置，用分規和直尺逐條測量短臂和長臂長度。根據測量的數據，計算染色體的相對長度，臂比和著絲粒指數。

相對長度=（每個染色體的長度／全部染色體長度）×100

臂比（率）=長臂長度／短臂長度

著絲粒指數=（短臂長度／該染色體長度）×100

著絲粒的位置：一般來說，每條染色體著絲粒的位置是恒定的，染色體的兩臂常在著絲粒處呈不同程度的彎曲。著絲粒位置的測定常用的方法是以染色體的長臂（L）和短臂（S）的比值來表示（表1）。

表1 染色體著絲粒位置確定Table 1 The position of chromosome centromere

2 結果

2.1 抗浪魚的染色體二倍體數目

觀察并計數了抗浪魚的100個清晰的中期分裂相，其染色體分布見表2。

表中統計數字表明，抗浪魚的細胞染色體數目在46～50之間。染色體總數為48占75%，少于或多于48的染色體占25%。由此可以確定抗浪魚2n數為48，這同已報道的抗浪魚2n數一致。

2.2 抗浪魚的染色體核型

按Levan A等的標準對染色體進行分類、命名，得到抗浪魚的染色體的相對長度、臂比、類型和著絲粒指數的數據（表3）。

表2 抗浪魚染色體數目Table 2 Chromosome number of Anabarilius grahami

表3 抗浪魚核型分析結果Table 3 The results of Anabarilius grahami karyotype

續表3

圖1 抗浪魚染色體中期分裂相Fig.1 The chromosome metaphase of Anabarilius grahami

3 討論

與其他魚類相比較，作為云南省重要的地方魚種，抗浪魚的分布不廣且受到了其他魚種的沖擊，再加上其種質資源的研究開展也較少，并且研究也不夠系統，所以抗浪魚染色體組型的研究成果尚不多見、也不夠全面，因此抗浪魚的核型研究具有較大意義。

3.1 抗浪魚的核型

根據表3數據可把抗浪魚的染色體分為3類：A類（編號1～14）：共有染色體7對，都為中部著絲粒染色體。B類（編號15～34）：共有染色體10對，都為近中著絲粒染色體。C類（編號35～48）：共有染色體7對，都為近端著絲粒。因此，可以確定抗浪魚的核型公式為2n=14m＋20sm＋14st，染色體的總臂數NF=82。與安晶等［7］在抗浪魚的二倍體數目、核型公式和染色體的總臂數NF的研究結果一致，試驗結果又一次確定了抗浪魚的核型，為抗浪魚的進一步研究提供了依據。

圖2 抗浪魚染色體核型Fig.2 The karyotype of Anabarilius grahami

3.2 抗浪魚與其他鯉科魚類的核型比較

鲌亞科中的星云白魚（Anabarilius andersoni）、大鱗白魚（Anabarilius macrolepis）、取自杞麓湖的銀白魚（Anabarilius alburnops）、取自滇池的銀白魚（Anabarilius alburnops）、黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda）、海南華鳊（Sinibrama melrosei）、銀飄魚（Pseudolaubuca sinensis）、廣東魴（Megalobrama terminalis）的染色體總數是一致的，都是2n=48，而核型公式和染色體的總臂數NF變異范圍很大［8-10］。鲌亞科魚類和抗浪魚同屬鲌亞科的黑尾近紅鲌、海南華鳊、銀飄魚、廣東魴只有染色體總數與抗浪魚相同，在核型公式和染色體的總臂數NF方面的差距較大，表現出了較大的進化差異性。與抗浪魚同屬鲌亞科白魚屬的星云白魚、大鱗白魚、銀白魚的染色體總數均為2n=48，與抗浪魚相同，但在核型公式和染色體的總臂數NF方面又與抗浪魚略微有所不同，展現出了抗浪魚在進化上的獨特性，體現了不同環境給魚類進化所帶來的不同影響；同時星云白魚、取自杞麓湖的銀白魚在染色體總數、核型公式、染色體的總臂數NF方面是極其相似的，體現它們在進化上的同源性，這個結論與先前楊君興的報道中對這3種魚共有一個最晚近的共同祖先的論述相互印證。從研究結果來看，想要將核型分析的結果做為抗浪魚種資檢測的指標是遠遠不夠的，若能進一步運用染色體帶型分析技術、光譜核型SKY技術、分子核型分析技術對抗浪魚的染色體進行研究，其結果將可能為提高抗浪魚的研究的準確性提供更有力的輔助。

［1］ 楊 博，陳小勇，楊君興.抗浪白魚線粒體DNA控制區結構和種群遺傳多樣性分析 ［J］.動物學研究，2008，29（4）：279-385.

［2］ 周麗青，楊愛國，吳 彪，等.波紋唇魚染色體制備及核型的初步研究 ［J］.漁業科學進展，2010，31（1）：54-58.

［3］ 蔡 巖，周永燦，謝瑞敏，等.布氏石斑魚的染色體核型、銀染和 C-帶 ［J］.水產學報，2012，36（5）：647-651.

［4］ 楊春英，賀一原，郭沐林，等.洞庭湖水系沅水和澧水2種黃顙魚的形態及染色體組型 ［J］.湖南文理學院學報：自然科學版，2011，23（4）：57-61.

［5］ 周麗青，楊愛國，吳 彪，等.波紋唇魚染色體制備及核型的初步研究 ［J］.漁業科學進展，2010，31（1）：54-58.

［6］ 蔡 巖，周永燦，張 本，等.海南野生三斑石斑魚染色體核型分析 ［J］.熱帶生物學報，2011，2（2）：98-100.

［7］ 安 晶，張桂賢，李運東，等.鯉魚凍血細胞培養及染色體制備條件優化研究 ［J］.現代農業科技，2012（2）：308-309.

［8］ 吉華松，周永燦，蔡 巖，等.六帶石斑魚染色體核型和銀染研究 ［J］.水產科學，2011，30（8）：465-466.

［9］ 孫增田，宋文華，丁 峰，等.萘醌化合物對斑馬魚肝臟染色體損傷研究 ［J］.云南大學學報：自然科學版，2012，34（2）：238-241.

［10］ 牟洪善，王昌留，李金萍.青島文昌魚（Branchiostoma belcheri tsingtauense）染色體G類帶型研究 ［J］.海洋與湖沼，2011，42（4）：597-602.