華東部分地區豬群中豬薩佩羅病毒分子流行病學調查

蘭道亮，吉文匯，王長松，孫 煥，陳莫林，崔 立，童光志，華修國＊

（1.上海交通大學農業與生物學院 上海市獸醫生物技術重點實驗室，上海200240；2.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海200241）

豬薩佩羅病毒（Porcine sapelovirus，PSV）是微球形，無囊膜包裹的一類RNA病毒，屬小RNA病毒科，由于最初從腹瀉豬的腸道中分離得到，所以先前統屬于腸道病毒屬中的豬腸道病毒Ⅱ群，稱為豬腸道病毒8型（PEV8）［1］。近年來，由于對腸道病毒基因組及進化關系的深入研究，該病毒已單獨劃分為薩佩羅病毒屬［2］。PSV可引起豬腦脊髓灰質炎、肺炎、繁殖障礙、心包炎、心肌炎、皮膚損傷、腹瀉等多系統綜合征，同時也可出現無明顯特征的亞臨床癥狀，但無論其以何種形式暴發，都會給養豬業帶來威脅。該病最早于20世紀60年代在英國發現［3］，隨后在北美、日本、澳大利亞等世界范圍內的其他國家相繼報道［4-8］，而且在飼養豬群中感染率很高［9-10］。

近年來，隨著規模化養豬業的發展及畜產品流通渠道的增多，我國豬群中腸道、呼吸道、生殖器官疾病以及腦脊髓炎等多系統綜合征頻繁發生，長期以來豬圓環病毒2型（PCV-2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細小病毒（PPV）、豬捷申病毒（PTV）被認為是引起該類疾病的主要病原體［11］，但PSV這個經典腸道病毒卻一直沒有引起相應的重視。目前為止，我國還未見對PSV的系統性研究報道。但鑒于PSV也可引起類似的臨床癥狀且可混合感染，使我們不得不考慮PSV這一感染因素。目前，豬病的發生越來越復雜，在控制重點傳統病的同時，對于一些我國還沒有開展研究或研究力度不夠的傳染病進行深入的研究也十分必要。因此，在我國開展PSV的研究工作，了解PSV流行情況，建立快速的病原學診斷方法，具有重要的意義。本研究主要通過設計的PSV鑒定引物，應用RT-PCR方法對華東地區豬群中PSV進行調查，通過序列比對分析其遺傳進化關系，為了解該病毒在華東地區的分布情況提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 2009年10月至2010年12月，從上海、江蘇、安徽等地的15個大中型養豬場（200頭～1 000頭母豬）共采集1月齡～5月齡臨床健康豬糞便樣本960份，其中從上海市崇明、浦東、閔行、南匯、金山區的6個豬場采集350份，從江蘇省宿遷市、鹽城市、鎮江市、蘇州市的4個豬場采集310份，從安徽省宿州市、阜陽市、滁州市、黃山市的5個豬場采集300份（表1），采集的新鮮豬糞便樣品立即置-80℃冰箱凍存。

1.1.2 主要試劑及儀器 Trizol為Invitrogen公司產品；Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit pMD-18T載體為寶生物工程（大連）有限公司產品；PCR Mix、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒為上海前塵生物技術有限責任公司產品；DH5αE.coli為天根生化公司產品。PCR儀PX2為美國Thermo Hybaid公司產品；核酸電泳儀Powerpac universalTM為美國Bio-Rad公司產品。

表1 采樣地區及樣品數量Table 1 The areas and numbers of specimen

1.2 方法

1.2.1 樣本的處理及總RNA的提取 取在-80℃保存的樣品，冰上溶化。用PBS液將樣品按照1∶10的比例稀釋，渦旋振動5min。在4℃條件下以12 000r／min離心10min，取上清。處理后的糞便上清供下游提取遺傳物質。然后取100μL糞便上清，利用Trizol法提取總RNA，具體操作方法按照Invitrogen產品說明書提取步驟進行。

1.2.2 RT-PCR檢測 參考Palmquist J M等［12］設計的PSV 5′保守區的通用檢測引物，擴增目的片段為 163bp。上游 引 物 PSV1：5′-GTGGCGACAGGGTACAGAAGAG-3′；下游引物 PSV-2：5′-GGCCAGCCGCGACCCTGTCAG-3′。以提取的樣本RNA為模板，按照Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit的說明書進行反轉錄，合成cDNA。反應參數為：42℃30min，85℃5s。然后取10μL反轉錄產物進行PCR反應，反應體系為：模板10μL，PCR mix 25μL；上游引物1μL；下游引物1μL；ddH2O為13μL。反應條件為：94℃3min；94℃30s，56℃40s，72℃40s，35個循環；72℃5 min，4℃結束反應。

1.2.3 PSV RdRp基因及VP1基因序列擴增 參考GenBank中已有PSV基因序列，自行設計擴增RdRp及VP1基因全長引物。RdRp基因擴增引物：上游引物 RdRp-F：5′-GCAGCCCTGTTGAAGAGAGACT-3′；下游引物RdRp-R：5′-ATA TGTTCACGCCGCCTAAAA-3′；VP1基因擴增引物：上游 引 物 VP1-F：5′-ATTGCCTAYACACCACCTGG-3′；下 游 引 物 VP1-R：5′-GCAGGTCTTCTCCCACAAAC-3′；參照1.2.2所述方法，對 PSV RdRp基因及VP1基因全序列進行RT-PCR擴增。

1.2.4 序列的克隆及測序 擴增后的PCR產物利用10g／L和50g／L凝膠電泳進行檢測。特異性目的條帶經割膠、純化回收后連接pMD-18T載體，隨后進行T／A克隆，挑取陽性重組質粒，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.5 系統進化分析 本試驗所得序列及其參考序列均整理成Fasta格式，通過ClustaXv1.8比對后保存生成的文件采用Mega 4.0系統進化分析軟件構建系統進化樹。本試驗中使用的小RNA科不同種屬病毒名稱及參考株序列號如下：

AiV，aichivirus（FJ890523）；ASV，avian sapelovirus（NC-006553）；BEV，bovine enterovirus（AF123432）；EMCV，encephalomyocarditis virus（NC-001479）；PEMCV，porcine encephalomyocarditis virus（DQ835184）；ERAV，equine rhinitis A virus（NC-003982）；ERBV，equine rhinitis B virus（NC-003077）；FMDV，foot-and-mouth disease virus （GU384683）； HAV，hepatitis A virus（EU526088）； HEV， human enterovirus（AB678778，HM185056，JN542510，AB601882）；HPeV，human parechovirus（AB668033）；HRV，human rhinovirus（JN990704，JN614997）；LjV，ljungan virus（NC-003976）；PEV，porcineenterovirus（Y14459，AF363455）；PKV，porcine kobuvirus （GU298977）；PSV，porcine sapelovirus（NC-003987，AY392543，AY392556，AY392544，AY392538）；PTV，porcine teschovirus （NC-003985）；SHAV，simian hepatitis A virus（SHVAGM27）；SV，simian sapelovirus（EU789367）。

2 結果

2.1 PSV檢測結果

960份臨床糞便總樣本，經RT-PCR檢測，共有165份樣本為PSV陽性樣本，總體陽性率為17.2%。各地區PSV陽性率如表2所示，其中安徽地區的PSV陽性感染率要明顯高于上海和江蘇地區（P＜0.05）。進一步分析不同年齡段豬的PSV陽性率，我們發現10周齡～20周齡的豬PSV陽性率最高，達到25.6%，大于20周齡的豬PSV陽性率最低為11.6%（表3），這表明10周齡～20周齡的豬的PSV感染率要顯著高于其他周齡的豬（P＜0.05）。

表2 華東地區15個豬場PSV的流行情況Table 2 Prevalence of PSV in 15farms located in East China

表3 不同年齡段豬的糞便樣本中PSV檢測結果Table 3 The prevalence of PSV in swine feces of different ages

2.2 系統進化分析

2.2.1 RdRp及VP1基因序列分析 從上海、江蘇、安徽三省市的陽性樣本中，各隨機選取8個樣本，擴增其RdRp基因及VP1基因全序列，并測序。然后，對這選取的24株PSV中國華東株分別進行RdRp基因及VP1基因的同源性比對。結果表明，這24株PSV中國華東株的RdRp基因間的同源性為87.0%～99.9%，同源性較高，而VP1基因間的同源性為72.4%～99.4%。

2.2.2 以RdRp基因為基礎的系統進化分析 利用ClustaX v1.8，將24株PSV中國華東株的RdRp基因序列與小RNA病毒科其他代表毒株的RdRp基因序列進行核苷酸比對，然后使用Mega 4.0系統進化分析軟件構建系統進化樹（圖1），本研究分離的毒株與GenBank中已有的PSV V13株聚為一類，且與SV-2和ASV同屬于薩佩羅病毒屬，而與小RNA病毒科的其他成員相距較遠。說明本研究分離的毒株為PSV，符合ICTV的分類條件。

2.2.3 以VP1基因為基礎的系統進化分析 將24株PSV中國華東株的VP1基因序列與微RNA病毒科其他代表毒株的VP1基因序列進行核苷酸比對，然后構建系統進化樹（圖2），上海、江蘇和安徽三省市的毒株交錯分布在一起，不存在明顯的地區差異，但大體可分為3個亞群，其中7株與Gen-Bank中已有的PSV V13、16-S-X、26-T-XII株聚為一個亞群，3株與GenBank中已有的PSV Sek1562／98、Po 5116株聚為一個亞群，而剩下的又聚為一個亞群。

3 討論

PSV很早便于英國發現，隨后在北美、日本、澳大利亞等世界范圍內的其它國家相繼有報道，而且在正常飼養豬群中感染率超過20%［9］。PSV可引起豬腸道、呼吸道、生殖器官疾病以及腦脊髓炎等多系統綜合征，同時也可出現無明顯特征的亞臨床癥狀，所以在疾病檢測和防控方面容易被忽略。目前，我國尚未對PSV開展深入研究，而且PSV在我國的流行情況還不十分清楚。

本研究通過RT-PCR方法對中國華東地區豬群中PSV的感染率進行了分子流行病學調查，從上海、江蘇、安徽三省市的13個地區收集的960份臨床健康豬糞便樣本中，共檢測到PSV陽性樣本165份，總體陽性率17.2%，并且在所檢測的13個地區均檢測到該病毒，這表明PSV在華東地區普遍存在。在所檢測的3個省市中，安徽省豬群平均感染率最高為22.3%，上海市豬群平均感染率最低為13.1%，在所檢測的13個地區中，情況類似，安徽省的阜陽地區豬群感染率最高為25.3%，上海市的崇明地區豬群感染率最低為10.0%，而江蘇省地區豬群的感染率介于二者之間。造成不同地區的感染率差異的原因可能與地區間的養殖狀況以及飼養管理方式有關。進一步分析不同年齡段豬的PSV陽性率，我們發現10周齡～20周齡的豬PSV陽性率最高，達到25.6%，表明在此年齡段的仔豬最易感，這與PEV的感染狀況類似［12-13］。我國仔豬的哺乳期在一般為4周～9周，由于哺乳期仔豬受到母源抗體保護，對PSV具有一定的抵抗力，而相關抗體在斷奶3周后降至最低［14-15］，所以易于受到PSV感染。這也提示加強斷奶仔豬，尤其是10周齡～20周齡仔豬的飼養管理，對于防控PSV有重要意義。總體來說，我國華東地區豬群中PSV的感染流行率，與國外報道的情況基本相同。但臨床健康豬群中20%以上的感染率不能不視其為危害養豬業的重要潛在威脅。

隨后從上海、江蘇、安徽三省市的陽性樣本中，隨機選取24個樣本，擴增其RdRp基因及VP1基因全序列，進行相關系統進化分析。以RdRp基因為基礎構建進化樹，分析其與小RNA病毒科其他種屬之間的關系，結果表明本研究分離的毒株與已有的PSV株歸為一類，且與SV-2和ASV同屬于薩佩羅病毒屬，而與小RNA病毒科的其它成員相距較遠。由于RdRp基因在小RNA病毒科各種屬成員中具有較高的保守性，成為區分小RNA病毒科中不同種屬成員的有力依據。同時，從RdRp基因進化樹中也可發現薩佩羅病毒屬與腸道病毒屬各歸為一類，存在一定的遺傳距離，這與國際病毒分類委員會將PSV從原先的PEV腸道病毒屬中單獨劃分出來的分類相符。進一步以PSV的外層衣殼蛋白基因VP1為基礎構建進化樹，分析24株PSV中國華東株間的進化關系。由于外層衣殼蛋白VP1在小RNA病毒科各種屬間具有多變性及良好的抗原性，所以被認為是劃分小RNA病毒科各種屬間不同亞型的有力依據［9，16］。VP1基因進化樹分析表明上海、江蘇和安徽三省市的毒株交錯分布在一起，不存在明顯的地區差異，但大體可分為3個亞群，而且已有的國外PSV均包括在這3亞群中。目前，PSV只有1個血清型，但PSV是否存在不同的基因亞型尚不清楚。Tseng C H等［2］證實PSV存在3種類型的抗原變異株，與本研究的進化分析結果相似，這提示PSV可能至少存在3種不同的抗原基因亞型。但關于PSV的亞型分型國際上尚無定論，還需進一步深入研究加以證實。

圖1 基于RdRp基因序列構建的系統進化樹Fig.1 The phylogenetic tree constructed based on the RdRp gene sequence

圖2 基于VP1基因序列構建的系統進化樹Fig.2 The phylogenetic tree constructed based on the VP1gene sequence

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