新城疫病毒抗體ELISA 檢測方法的建立與應用

索南元旦

（青海省玉樹州畜牧獸醫工作站，青海玉樹815000）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus）的新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽類高度接觸性、烈性傳染病，被世界動物衛生組織（OIE）列為必須報告的動物傳染病，呈世界性分布，每年全球因雞新城疫所造成的直接經濟損失達數十億元，是危害全球養雞業的最重要傳染病之一［1-5］。該病也是影響我國養禽業健康發展的重要疫病之一，對我國禽類產品的食品安全以及人類健康都存在著潛在危害［6-7］。NDV常規的病毒分離技術和分子生物學檢測方法存在周期長、操作復雜等缺點，無法滿足基層獸醫部門大批量樣品檢測的需要。NDV基因組全長15186bp，編碼6種結構蛋白，其中血凝素-神經氨酸酶糖蛋白（HN）為病毒囊膜蛋白，是病毒復制必需蛋白，為病毒特異性保護性抗原，存在中和B細胞抗原表位，能夠誘導機體產生特異性免疫應答，是NDV診斷試劑研究的常用蛋白［8-11］。本研究以重組HN蛋白為包被抗原，建立了一種簡單、快速、特異、敏感新城疫病毒抗體檢測方法，為基層獸醫部門新城疫病毒抗體的檢測、監測及流行病學調查等提供一種有效的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原與血清 原核表達的新城疫病毒重組HN蛋白由青海省動物疾病中心實驗室制備并保存。H9亞型禽流感病毒（H9AIV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）、減蛋綜合征病毒（EDSV）陽性血清及NDV參考陰性、陽性血清均購自中國獸醫藥品監察所。檢測用血清樣品由青海省動物疾病中心實驗室收集并保存。

1.1.2 主要試劑 辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗雞IgG為Sigma公司產品；TMB底物液購自天根生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 包被抗原 純化的新城疫病毒重組HN蛋白經SDS-PAGE分析驗證后，采用Bradford法測定蛋白濃度，置于-70℃保存。

1.2.2 NDV HN間接ELISA操作程序 將純化后的重組HN抗原用碳酸鹽緩沖液（CBS）適當稀釋后，每孔100μL包被ELISA反應板，置4℃過夜。次日洗滌后，加入適當封閉液，置37℃封閉適當時間。洗滌后，加入適當稀釋后的血清樣品（一抗），置37℃作用適當時間。洗滌后，加入適當稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗雞IgG（酶標二抗），置37℃作用適當時間。洗滌后，每孔加入100μL TMB底物顯色液，置37℃作用適當時間。加入2mol／L H2SO4終止反應。用酶標儀在波長450 nm處測定每孔的吸收值（OD450nm值）。

1.2.3 NDV HN間接ELISA反應條件的優化

1.2.3.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 采用方陣滴定法，將不同濃度（51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4μg／mL）重組的 HN蛋白與不同稀釋度（1∶50、1∶100、1∶200、1∶400）的一抗組成方陣，保持其他反應條件不變，確定最適合的抗原最佳包被濃度和一抗最佳稀釋度。

1.2.3.2 酶標抗體最佳稀釋度與最佳作用時間的確定 采用方陣滴定法，將不同稀釋度（1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000）的 HRP標記的兔抗雞IgG 與酶標抗體不同作用時間（30、60、90、120 min）組成方陣，保持其他反應條件不變，確定最佳的酶標抗體稀釋度和作用時間。

1.2.3.3 最佳封閉液與最佳封閉時間的確定 采用方陣滴定法，將不同封閉液（50g／L脫脂奶粉、10 mL／L BSA、100mL／L小牛血清、PBST）與不同封閉時間（30、60、90、120min）組成方陣，保持其他反應條件不變，確定最佳封閉液與封閉時間。

1.2.3.4 一抗最佳作用時間的確定 一抗分別作用30、60、90、120min，保持其他反應條件不變，確定最佳的一抗作用時間。

1.2.3.5 TMB底物最佳作用時間的確定 TMB底物分別作用5、10、15、20min，保持其他反應條件不變，確定最佳的底物作用時間。

1.2.4 NDV HN間接ELISA判斷標準的確定

利用NDV HN間接ELISA已確定的最佳反應條件檢測48份NDV陰性血清樣品，計算48份樣品的OD450nm平均值（ˉX）和標準差（SD），將ˉX＋3SD設為臨界值。即樣本OD450nm≥ˉX＋3SD判為陽性，樣本OD450nm＜ˉX＋2SD判為陰性，當ˉX＋2SD≤樣本OD450nm＜ˉX＋3SD判為可疑。

1.2.5 交叉反應試驗 用已建立的NDV HN間接ELISA檢測 AIV（H9亞型）、IBV、IBDV、EDSV 陽性血清，同時設NDV陽性血清和陰性血清對照，確定檢測方法的特異性。

1.2.6 靈敏度檢測 將NDV陽性血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶1 2800、1∶25 600稀釋，用已建立的NDV HN間接ELISA檢測，確定檢測方法的敏感性。

1.2.7 重復性試驗

1.2.7.1 批內重復性試驗 選取NDV陽性血清樣品和陰性血清樣品各3份，在相同時間用同一塊ELISA反應板檢測，每份血清樣品做6個重復，統計變異系數。

1.2.7.2 批間重復性試驗 選取NDV陽性血清樣品和陰性血清樣品各3份，在4個不同時間分別用4塊ELISA反應板檢測，統計變異系數。

1.2.8 臨床應用 應用已建立的NDV HN間接ELISA和血凝抑制試驗（HI）同時檢測采集于各地的568份血清樣品，統計血清抗體陽性率，同時統計NDV HN間接ELISA方法相對于HI的特異性、敏感性及符合率。

2 結果

2.1 診斷抗原的制備

純化的重組HN蛋白（圖1）經Bradford法測定濃度為0.512mg／mL。

圖1 HN純化蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified HN protein

2.2 NDV HN間接ELISA最佳反應條件的確定

經優化，重組抗原最佳工作濃度為3.2μg／mL，血清最佳稀釋度為1∶100；酶標抗體最佳稀釋度為1∶4 000，最佳作用時間為60min；最佳封閉液為10 mL／L BSA，最佳封閉時間為60min；一抗最佳作用時間為60min；TMB底物最佳作用時間為15min。

2.3 NDV HN間接ELISA判定標準的確定

NDV HN間接ELISA檢測48份NDV陰性血清樣本的OD450nm平均值和標準差分別為0.202與0.061。計算出NDV HN間接ELISA的判斷標準為：樣本OD450nm≥0.385為陽性；樣本OD450 nm＜0.324為陰性；0.324≤樣本OD450nm＜0.385為可疑，對可疑樣本須重新檢測。

2.4 交叉反應試驗結果

如表1所示，NDV HN間接ELISA檢測AIV（H9亞型）、IBV、IBDV、EDSV 陽性血清的 OD450 nm值均低于0.324，不發生交叉反應，表明建立的檢測方法具有較好的特異性。

2.5 靈敏度檢測試驗結果

如圖2所示，NDV HN間接ELISA檢測NDV陽性血清的最低稀釋度為1∶12 800（OD450nm=0.401），表明建立的檢測方法具有較好的敏感性。

2.6 重復性試驗結果

批內重復性試驗的變異系數集中在3.24%～4.55%之間（表2）；批間重復性試驗的變異系數集中在4.12%～8.22%之間（表3）。表明建立的檢測方法具有較好的重復性。

表1 交叉反應試驗結果Table 1 Result of cross-reaction

圖2 NDV HN間接ELISA靈敏度檢測Fig.2 Sensitivity test of NDV HN indirect ELISA

2.7 臨床應用檢測結果

568份血清樣品，用NDV HN間接ELISA檢測出陽性樣品466份，陽性率為82.0%；HI檢測出陽性樣品458份，陽性率為80.6%。HI檢測為陽性的458份血清樣品，用NDV HN間接ELISA檢測，陽性451份，陰性7份，NDV HN間接ELISA相對于HI的敏感性為98.5%（451／458）；HI檢測陰性的110份血清樣品，NDV HN間接ELISA檢測出陰性95份，陽性15份，NDV HN間接ELISA相對于HI的特異性為86.4%（95／110）；HN間接ELISA相對于 HI的總符合率為96.1%（546／568）。

表2 批內重復性試驗結果Table 2 Intro-batch repetition test

表3 批間重復性試驗結果Table 3 Inter-batch repetition test

3 討論

目前，對于新城疫病毒的診斷主要以病毒的分離鑒定和分子生物學方法等病原學檢測手段為主，病原學檢測方法雖然準確，但試驗周期長、操作復雜、不適合大批量樣品檢測。血清學等抗體檢測方法雖然目前不能有效區分自然感染抗體和疫苗免疫抗體，但由于血清樣品采集方便、容易保存和高通量檢測等優點而被廣泛應用，且在知道流行病學的前提下，證實其抗體陽性就已經具有了診斷意義。目前新城疫的抗體檢測主要以血凝抑制試驗（HI）為主，HI雖然操作簡單、但存在敏感性較低，血清的質量對檢測結果影響較大，肉眼判讀、誤差大等缺點，不適合基層獸醫工作者廣泛使用。隨著酶免疫技術的發展，ELISA逐步應用于新城疫病毒的抗體檢測，Snyder D B等［12］利用純化的新城疫全病毒作為包被抗原，建立了檢測新城疫抗體的間接ELISA方法。Thayer S G等［13］通過比較間接 ELISA、HI、AGP三種新城疫病毒抗體檢測方法，得出間接ELISA方法具有微量、敏感、特異、高通量的優點，將在新城疫抗體的檢測上具有廣闊的應用前景。張國中等［14］分別采用間接ELISA和HI兩種方法對臨床上收集的152份HI滴度不同的血清樣品和ND的標準陰、陽性血清進行了新城疫病毒抗體檢測，并分析了間接ELISA和HI兩種方法的相關性，得出間接ELISA快速、高通量、敏感、特異，較HI更適合于新城疫抗體的檢測和流行病學調查。但以往的間接ELISA多以全病毒作為包被抗原，全病毒由于受病毒培養與純化方面的限制，存在特異性低、成本高、容易散毒等缺點，而HN蛋白為NDV主要的免疫原蛋白，檢測抗HN蛋白抗體水平與檢測抗全病毒抗體水平存在一致性。劉鈾等［11］用T4噬菌體表達的重組新城疫病毒HN蛋白為包被抗原，建立了檢測新城疫抗體的間接ELISA方法，該方法檢測靈敏度明顯高于HI和AGP試驗，但該研究未進行靈敏度的標定，也沒有進行臨床樣品的應用檢測，沒有對該檢測方法進行應用評價。本研究以原核表達的NDV HN重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測NDV HN抗體的間接ELISA診斷方法，該檢測方法顯示出了較好的特異性、敏感性、重復性和適用性，將具有良好的使用前景。本實驗室將進一步進行間接ELISA試劑盒穩定劑的研究工作，以便盡早將該檢測方法組裝成診斷試劑盒，為NDV抗體檢測、流行病學調查等提供一種簡便、敏感、快速、特異的血清學診斷試劑盒。

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