PEG 介導細胞融合最適條件的探討

王 惠，郭 峰，關 超，張 梅，關 萍＊，白洪志

（1.沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧沈陽110866；2.沈陽農業大學土地與環境學院，遼寧沈陽110866）

細胞融合（cell fusion），又稱細胞雜交，是指在外力的作用下2個或2個以上的細胞融合成一個雙核或多核細胞的現象，因此又稱細胞雜交。細胞融合技術是研究細胞遺傳、基因定位、細胞免疫、病毒、腫瘤和培育生物新品種的重要手段［1-3］，尤其是近年來發展起來的新研究技術有著更為重大的實踐意義［4-7］。細胞融合的方法包括仙臺病毒誘導法、物理融合技術（電融合技術）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）法等。其中PEG法誘導細胞融合以其容易制備、活性穩定、不需要特別的儀器設備、操作方便等優點，被普遍用于生物、遺傳、醫藥等研究領域［8-9］。但 該 方 法 也 受 許 多 因 素 的 影 響［10-15］，如PEG濃度、融合溫度、融合時間等。

本試驗選取雞紅細胞、兔紅細胞、蟾蜍紅細胞作為同源與異源細胞研究的試驗材料，從PEG濃度、融合溫度、融合時間三個方面進行單因素探索，以期找到融合率最高時的條件，達到更好的融合效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 不同濃度的PEG（Mr=4 000）：250、500、750mL／L PEG；380g／L檸檬酸鈉；8.5g／L生理鹽水；GKN液；Hanks液；750mL／L酒精。

1.1.2 儀器 電子天平，恒溫水浴鍋，低速離心機，微量移液槍，光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度PEG的配制 稱取少許PEG（Mr=4 000）放入小燒杯中，沸水浴加熱，使其熔化，分別移取等量的3份至刻度試管中，待冷至50℃時，分別加入預熱的3倍體積、1倍體積、1／3體積的GKN液，混勻，配成250、500、750mL／L的PEG。

1.2.2 紅細胞的采取及細胞懸液的制備 用滅菌的注射器吸入38g／L的檸檬酸鈉2mL，從用750 mL／L酒精消過毒的雞翼靜脈處（兔是從耳緣靜脈處，蟾蜍是從主動脈弓處）采取靜脈血轉入事先裝有38g／L的檸檬酸鈉的燒杯中使檸檬酸鈉與血液的體積比為1∶4，放入4℃冰箱中保存。

取懸液1mL移入10mL的刻度離心管內，加入8.5g／L生理鹽水4mL混勻，1 500r／min離心5 min；棄上清液（用吸管吸去），加8.5g／L生理鹽水至5mL，混勻后1 500r／min再離心5min；重復上述操作，再離心洗滌1次；收集最后一次離心沉淀的紅細胞，用手指輕彈底壁使沉淀松散［9］。用微量移液器移取細胞沉淀至干凈試管中，加入9倍體積的GKN液，配成100mL／L的細胞懸液。

1.2.3 細胞融合的方法 試驗分6組進行，同源3組，異源3組，分別為雞-雞、兔-兔、蟾蜍-蟾蜍、雞-兔、雞-蟾蜍和兔-蟾蜍的紅細胞融合，每組10只試管進行單因素試驗，篩選出每組融合的最佳條件。

1.2.3.1 PEG濃度對同源、異源紅細胞融合最適條件的探索 分別取紅細胞懸液200μL（同源組取200μL，異源組則分別取異源的兩種紅細胞各100 μL）至3個刻度離心管中，分別加入預熱的100μL的250、500、750mL／L的PEG，放于37℃水浴鍋內溫浴5min后，再分別加入Hank＇s液5mL，靜置2 min以終止PEG的作用；用微量移液器移取少量紅細胞懸液至血球計數板上，蓋上蓋玻片，觀察紅細胞融合情況。

1.2.3.2 融合時間對同源、異源紅細胞融合最適條件的探索 分別取紅細胞懸液200μL（同1.2.3.1）至3個刻度離心管中，分別加入預熱的100μL上一項試驗中融合率最高時的PEG，放于37℃水浴鍋內溫浴5、10、15min后，再分別加入 Hank＇s液5 mL，終止PEG的作用，觀察紅細胞融合情況。

1.2.3.3 融合溫度對同源、異源紅細胞融合最適條件的探究 分別取紅細胞懸液200μL（同1.2.3.1）至3個刻度離心管中，分別加入預熱的100μL上一項試驗中融合率最高時的PEG，分別放于23℃、30℃、37℃、44℃水浴鍋內溫浴上一項試驗中測得的融合率最高時的融合時間，再分別加入Hank＇s液5 mL，終止PEG的作用，觀察紅細胞融合情況。

1.2.4 細胞融合率的計算 在顯微鏡視野里，每個視野下讀取計數板中間大方格中四角中方格及中心中方格中融合的細胞及未融合的細胞數（注意區分融合細胞與重疊細胞［16］），用下面的公式計算每方格內的融合率，取平均值。

融合率=融合的細胞數／總細胞數×100%［17］

2 結果

2.1 PEG介導的紅細胞融合的最適條件探索

2.1.1 PEG濃度對同源、異源紅細胞融合最適條件的探索 在37℃、5min融合時間處理條件下，各種類型同源、異源紅細胞融合時，PEG為250mL／L的融合率最低，PEG為750mL／L的融合率次之，PEG為500mL／L的融合率最高，其中，同源紅細胞融合中，以兔同源紅細胞融合率最高為37.8%，異源紅細胞融合中，以兔-蟾蜍異源紅細胞融合率最高為11.1%（表1）。

表1 不同濃度PEG同源、異源紅細胞融合率Table 1 Cell fusion rates of isogenous，heterogenous erythrocytes in different PEG concentrations %

2.1.2 融合時間對同源、異源紅細胞融合最適條件的探究 在PEG 500mL／L、37℃處理條件下，各種類型同源、異源紅細胞融合時，融合時間5min的融合率最低，10min的融合率次之，15min的融合率最高（蟾蜍例外，在10min融合率最高）。其中，同源紅細胞融合時，以兔同源紅細胞融合率最高為38.2%，異源紅細胞融合中，以兔-蟾蜍異源紅細胞融合率最高為12.7%（表2）。

表2 不同融合時間同源、異源紅細胞融合率Table 2 Cell fusion rates of isogenous，heterogenous erythrocytes in different response time %

2.1.3 融合溫度對同源、異源紅細胞融合最適條件的探究 在融合時間15min、PEG 500mL／L條件下，各種類型同源、異源紅細胞融合時，融合溫度23℃的融合率最低，30℃的融合率次之，37℃的融合率最高，溫度升高至44℃時，融合率反而下降。其中，同源紅細胞融合時，以兔同源紅細胞融合率最高為39.3%，異源紅細胞融合時，以兔-蟾蜍異源紅細胞融合率最高為14.0%（表3）。

2.2 條件分析

2.2.1 PEG濃度對紅細胞融合效果的影響 根據PEG誘導細胞融合的原理可知，PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。在不同濃度PEG溶液中，由于PEG-水之間的氫鍵結合，導致兩個細胞接觸點的質膜的脂類分子發生重組和疏散，由于兩細胞接口處質膜的雙分子層之間的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而促使細胞發生融合，理論上，所用PEG濃度越高，細胞融合效果應該越好。由表1試驗數據可知，PEG為500 mL／L時，紅細胞融合率最高，而PEG為750mL／L對細胞的毒性過大，試驗過程也顯示PEG為750 mL／L時質膜結構發生大的變化，出現部分細胞破碎。

表3 不同融合溫度同源、異源紅細胞融合率Table 3 Cell fusion rates of isogenous，heterogenous erythrocytes in different reaction temperature %

2.2.2 融合時間對紅細胞融合效果的影響 由表2可知，蟾蜍同源紅細胞融合組的最適融合時間是10min，其余組均為15min，但仔細分析數據可發現，每組10min與15min時的融合率差距并不是很大。因此，可知融合時間對雞紅細胞的融合率影響不很明顯，融合率不隨時間的推移發生顯著變化，這是由于PEG誘導細胞的膜間發生接觸、黏連，使細胞開始融合，經離心去除PEG后，黏連的細胞便隨融合的進程自然進行所致。

2.2.3 融合溫度對紅細胞融合效果的影響 由表3可知，各種類型同源、異源紅細胞融合時，均表現隨著溫度的升高，融合率逐漸增高，在37℃時融合率達到最大，此后隨著溫度繼續升高，融合率開始下降。理論研究可知，在一定范圍內，細胞脂雙層膜會隨著溫度的升高而流動性增強。流動性的增強也有益于細胞間細胞膜的融合，提高融合率，但過高溫度也會使細胞因承受不了高溫而失去活性，引起融合率降低。尤其是當融合的細胞是蟾蜍類的冷血動物時，其紅細胞對溫度更為敏感。

2.3 融合率的差異性分析

2.3.1 同源組融合率的差異性分析 同源紅細胞融合時，雞同源紅細胞在PEG為500mL／L、37℃、15min條件下，融合率7.0%；兔同源紅細胞在PEG為500mL／L、37℃、15min條件下，融合率39.3%；蟾蜍同源紅細胞在PEG為500mL／L、37℃、10min條件下，融合率10.8%。都是最適條件，但融合率差距較大。從幾何學的角度分析可以知道，兔紅細胞呈球形，可以減少運動時的阻力，因此球形細胞比橢球形運動速度快，與其他細胞接觸機會大大增高，導致融合率比橢球形的雞紅細胞、蟾蜍紅細胞都高。且在相同細胞密度下，細胞體積越大，細胞間碰觸的機會也高，這也是雖外觀都為橢球形，但蟾蜍紅細胞融合率高于雞紅細胞的原因。

2.3.2 異源組融合率的差異性分析 異源紅細胞融合時，在最適條件下，雞-兔異源紅細胞融合率為10.4%，雞-蟾蜍異源紅細胞融合率為6.2%，兔-蟾蜍異源紅細胞融合率為14.0%。雞-兔異源紅細胞、兔-蟾蜍異源紅細胞融合效果都略高于雞、蟾蜍同源時的融合效果，其原因均可歸結為兔紅細胞具有球形外觀，其本身的運動性高于其他兩種細胞，因此使得異源細胞間的接觸機會高于雞與蟾蜍同源接觸機會，且在兔-蟾蜍異源紅細胞融合時，視野下可看到由于兔與蟾蜍紅細胞體積差距5倍左右，一個蟾蜍紅細胞可同時與多個兔紅細胞接觸并進一步融合，使融合率有所提升。但整體可看出異源細胞間的融合率明顯低于同源間，分析原因，可能由于不同物種間的差異性造成的。

綜上，從單因素試驗及結果分析中可以看出，除蟾蜍同源紅細胞融合組的最適融合條件為PEG為500mL／L、37℃、10min反應時間，其余組，無論是恒溫動物還是變溫動物紅細胞，其細胞融合的最適條件均為PEG 500mL／L、37℃、15min反應時間。但從融合率上可見兔紅細胞同源融合率遠高于其他各組，而整體上同源組的融合率高于異源組。

3 討論

本試驗采用雞、兔、蟾蜍紅細胞為原材料取材既簡單方便又新鮮可行，且一次性采血量較大，可滿足大量學生使用，成本不會增加。就融合條件而言，PEG最適濃度為500mL／L，這是由于PEG濃度過高時，其細胞反應液體環境黏滯度過高，可能會阻礙細胞融合。最適溫度37℃，高于30℃，這是因為隨著溫度升高，細胞膜的流動性增強，有益于融合，而過高溫度也會使細胞因承受不了高溫而失去活性，引起融合率降低。而10min與15min反應時間的融合率差距并不是很大，對紅細胞的融合率影響不太明顯，融合率不隨時間的推移發生顯著變化，這是由于PEG誘導細胞的膜間發生接觸、黏連，使細胞開始融合，經離心去除PEG后，黏連的細胞便隨融合的進程自然進行所致。

PEG法誘導細胞融合以其容易制備、活性穩定、不需要特別的儀器設備、操作方便等優點，被普遍用于生物、遺傳、醫藥等研究領域。因此，對PEG介導細胞融合的最適條件探究顯得尤為必要。相信隨著研究的不斷深入，細胞融合技術的應用領域越來越廣［18］，產生的影響也日益顯著。

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