小鼠胃內消化對胰蛋白酶抑制劑活性影響的初步研究

關 萍，于業輝，王 惠，張 梅，張立軍＊

（1.沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧沈陽110866；2.沈陽農業大學畜牧獸醫學院，遼寧沈陽110866）

植物的胰蛋白酶抑制劑（trypsin inhibitor，TI）是對胰蛋白酶（trypsin，TP）具有抑制作用的一類多肽類物質，它對植物本身具有保護作用，可防止植物籽粒自身發生分解代謝，使種子處于休眠狀態，能調節植物蛋白質的合成與分解等［1］。近年來，TI成為科學研究的熱點，主要原因為前些年受到普遍關注的TI抗蟲效應和近些年TI對高等動物和人類的治病與致病的雙重效應：①TI的抗蟲效應。TI能顯著抑制昆蟲的生長發育，可誘導中腸TP活力的增高，使正常消化過程蛋白酶間的協調性破壞，導致昆蟲生長發育受阻［2］，利用TI基因進行抗蟲轉基因植物育種已被證明是一種行之有效的方法［3-4］；②TI的臨床應用。利用TI治療急性胰腺炎［5］，應用于外科手術的促凝血作用［6］，TI的抗腫瘤作用［7］等；③TI的過量攝入對高等動物和人類的危害。TI可引起胰腺增生，TP過量分泌，導致消化不良、生長停滯，甚至危及生命［8］。這3個研究方面的既獨立又相關。轉TI抗蟲基因必然會造成TI的過量表達，如果這種植物是高等動物或人類的主要食物來源，過量表達的TI攝入動物機體后，能否對機體造成有害影響？Hilder V A等［9］報道，昆蟲消化系統的結構和功能均與高等動物有所不同，隨食物進入高等動物胃內的TI會在胃蛋白酶和胃酸的作用下被分解而完全失活，因此不會影響動物體的正常生理過程，但該結論缺乏詳細的試驗研究。Feng G H等［10］報道，TI的適量攝入對機體無害而有益，但這種結論過于籠統，TI對高等動物治病還是致病，與動物的機能狀態和攝入劑量密切相關，不能一概而論。可以肯定的是，對于正常高等動物，機體內過量存在的TI會對正常新陳代謝活動產生嚴重影響，值得探討的是TI在隨食物攝入動物體，通過胃內消化在胃蛋白酶和胃酸作用下分解和活性保持程度如何？本研究的目的在于解決這個問題，詳細研究高等動物隨食物攝入不同劑量的TI，在胃蛋白酶和胃酸作用下，TI活性的變化及對動物體主要消化道和消化腺TP活性和分泌的影響。分析高等動物消化系統對TI的分解程度，試圖建立TI的攝入劑量與TP活性的關系，從而為尋求TI的安全劑量、TI的臨床應用、作用機理分析等相關研究提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 2月齡昆明種SPF級小鼠160只，購自中國醫科大學實驗動物中心，體重33g左右，性別隨機，按雌雄分籠飼養。

1.1.2 試劑 胰蛋白酶抑制劑為沈陽大東銀河鑫試劑公司產品；小鼠胰蛋白酶ELISA檢測試劑盒為上海滬峰試劑公司產品；氯化鈉為市售。

1.1.3 儀器與用具 酶標儀，高速離心機，組織勻漿器，微量取樣器，電子天平，小鼠灌胃器等，由沈陽農業大學生物科學技術學院專業實驗室和畜牧獸醫學院動物醫學實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的常規培養 培養地點為沈陽農業大學實驗主樓動物飼養室，晝夜室溫14℃～22℃，飼養室保證陽光充足但不曝曬，空氣流通性良好，室內濕度保持在50%～70%，每籠小鼠數量不超過4只，每隔24h添加更換一次食物和飲用水，每隔24h更換一次墊料，每隔48h消毒飼養室地面。

1.2.2 試驗分組和給藥方法 試驗開始前將小鼠隨機分配為8組，每組20只，對照組（急性試驗）～高劑量TI組（急性試驗）用于試驗1.2.3，以下簡稱為對照組（AE）～高劑量TI組（AE）。

對照組（AE）（生理鹽水組），實驗動物進食進水后0.5h左右，每只試驗動物通過灌胃途徑給予生理鹽水0.1mL（以下給藥方法同對照組）。低劑量TI組（AE）：給予7.5×10-3mg／mL TI 0.1mL；中劑量TI組（AE）：給予2.25×10-2mg／mL TI 0.1 mL；高劑量TI組（AE）：給予3.75×10-2mg／mL TI 0.1mL。

對照組（慢性試驗）～高劑量TI組（慢性試驗）用于試驗1.2.4，以下簡稱為對照組（CE）～高劑量TI組（CE）：

對照組（CE）（生理鹽水組）：實驗動物每日固定時間進食進水后1h左右，每只試驗動物通過灌胃途徑給予生理鹽水0.1mL（以下給藥方法同對照組（CE））。低劑量TI組（CE）：給予7.5×10-3mg／mL TI 0.1mL；中劑量 TI組（CE）：給予2.25×10-2mg／mL TI 0.1mL；高劑量 TI組（CE）：給予3.75×10-2mg／mL TI 0.1mL。

1.2.3 急性試驗 通過測定TP活性反映一個胃排空周期胃內消化對TI分解程度，將對照組（AE）～高劑量TI組（AE）實驗動物按照1.2.1方法正常培養7d后，試驗前1d晚22時后停止供食，試驗當天6：00左右恢復供食供水，觀察試驗動物進食進水情況，正常進食進水后撤去剩余食物和水0.5h后按照1.2.2方法給藥，給藥4h后將試驗小鼠脫臼法處死，迅速取其十二指腸段。組織稱重后備用（十二指腸段禁止反復沖洗以保存腸腔內容物）。根據所取組織重量加入適量生理鹽水，用勻漿器制成100 g／L組織勻漿，高速離心機9 000r／min離心10 min，取上清液備用。

應用小鼠胰蛋白酶ELISA檢測試劑盒，按照說明書步驟操作：配制TP標準品，測量標準品OD值，繪制標準曲線，列出標準曲線的回歸方程。測量4組每只小鼠十二指腸TP的OD值，計算酶含量。

1.2.4 慢性試驗 未分解TI對胰腺TP活性及分泌影響，將對照組（CE）～高劑量TI組（CE）組實驗動物按照1.2.1方法正常培養7d后，開始給藥前編號并稱量體重，按1.2.2方法給藥。培養28d后，停止供食12h，停止供水6h，稱量體重后脫臼法處死。迅速取其胰腺，組織勻漿制備和TP測量方法同1.2.3。

1.2.5 統計學處理 試驗數據采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，分析結果以（±sD）表示，組間差異顯著性采用單因素方差分析和多重比較（LSD和Games-Howell）。

2 結果

2.1 TI作用下小鼠體重變化

試驗開始前為每只小鼠編號、稱重，試驗后處死前重新稱重，計算試驗前體重平均值、試驗后體重平均值和體重增長平均值，結果見表1。

表1 TI對小鼠體重的影響Table 1 Effects of TI on body weight in mice

2.2 標準酶液OD值的測定和標準曲線的繪制

應用小鼠胰蛋白酶ELISA檢測試劑盒，測定標準品OD值，繪制標準曲線，列出標準曲線的回歸方程：y=0.001 6x-0.001 4（R2=0.991 5）（表2和圖1）。

表2 胰蛋白酶標準品含量和OD值的關系Table 2 The relationship between trypsin standard content and OD value

圖1 胰蛋白酶標準曲線Fig.1 trypsin standard curve

2.3 TI作用下小鼠十二指腸內容物及腸壁內TP活性影響

應用小鼠胰蛋白酶ELISA檢測試劑盒，測量對照組（AE）～高劑量TI組（AE）每個樣品十二指腸TP OD值，根據回歸方程計算酶活性（表3）。

表3 TI對十二指腸內容物和腸腺TP活性的影響Table 3 Effects of TI on duodenal contents and midgut gland TP in mice

2.4 TI作用下胰腺TP活性和分泌變化

應用小鼠胰蛋白酶ELISA檢測試劑盒，測定對照組（CE）～高劑量TI組（CE）每個樣品胰腺TP OD值，根據回歸方程計算酶活性（表4）。

表4 TI對胰腺TP活性的影響Table 4 Effects of TI on pancreas TP in mice

3 討論

由表1分析可知，對照組（CE）小鼠試驗前后體重增加1.6g±0.34g，低劑量TI組（CE）體重下降0.26g±2.24g，中劑量TI組（CE）下降0.69g±2.61g，高劑量TI組（CE）增加0.06g±4.78g。相對于對照組（CE），低、中、高劑量 TI組（CE）3組體重下降值差異顯著（P＜0.05）。體重可作為動物在一定時期新陳代謝活動是否正常的初步判定指標，因此不同劑量TI的攝入可初步判定均對試驗動物的生理活動產生了負面影響導致體重增加下降，這與研究報道是一致的［8］。由表3分析可知，十二指腸內容物及腸腺中TP活性對照組（AE）為144.62 pg／mL±57.17pg／mL，低劑量 TI組 （AE）為138.38pg／mL±33.23pg／mL，中劑量TI組（AE）為119.64pg／mL±56.77pg／mL，高劑量 TI組（AE）為107.09pg／mL±49.50pg／mL。相對于對照組（AE），低劑量 TI組（AE）顯著下降（P＜0.05），中、高劑量 TI組（AE）極顯著下降 （P＜0.01），TI劑量與IP活性呈正相關性。可以得出的結論是，在一個胃排空周期內不同劑量的TI均未被胃內消化完全分解并不同程度的抑制了TP活性，這與Hilder V A的研究報道不同［9］。由表4分析可知，由于TI的長期過量作用，胰腺TP活性和分泌量發生了顯著或極顯著變化，這種變化與給藥劑量不呈正相關性。對照組（CE）為342.12pg／mL±35.80pg／mL，低劑量 TI組（CE）為 279.86 pg／mL±10.72pg／mL，中劑量 TI組為 （CE）391.32pg／mL±21.93pg／mL，高劑量 TI組為（CE）360.10pg／mL±22.56pg／mL，低劑量 TI組（CE）TP活性極顯著低于對照組（CE）（P＜0.01），中劑量TI組（CE）極顯著高于對照組（CE）（P＜0.01）而高劑量TI組（CE）的IP含量則顯著高于對照組（CE）（P＜0.05）。這種結果的產生是由于，一方面TI可直接抑制消化系統中的TP活性，另一方面TI可直接作用于胰腺導致TP的過量分泌，表4顯示的TP活性為這兩種作用的協同效應［11］。中、高劑量TI組（CE）均表現為刺激分泌效應大于抑制作用，而低劑量TI組（CE）則表現為抑制作用占優勢。TP作為高等動物消化過程中發揮主要作用的消化酶［12］，TP含量發生顯著的變化勢必會對消化過程產生負面影響，因此仍具有部分活性的TI直接影響了高等動物體的消化過程進而影響到整體新陳代謝是顯而易見的。

本研究通過不同劑量TI在一個胃排空周期對消化系統中TP活性的急性作用和一個繁殖周期的慢性作用，總結出通過攝食途徑進入高等動物體的TI對TP活性和分泌的影響及動物機體的整體影響，為目前開展關于TI的相關研究（轉TI抗蟲基因植物對高高動物消化能力的影響、TI的臨床治療使用劑量及給藥途徑等）提供了理論依據，但本文僅提供了初步研究結果，TI攝入后的降解過程、TI的攝入劑量與動物致病性的關系及TI對機體作用的機理分析等還需深入研究和探討。

［1］ 徐文靜，李莉云，史佳楠，等.Bowman-Brik胰蛋白酶抑制劑在水稻葉片生長和種子萌發過程中的表達［J］.農業生物技術學報，2012（3）：246-253.

［2］ Ryan C A.Proteinase inhibitors in plants，genes for improving defenses against insects and pathogens［J］.Annu Rev Phytopathol，1990（28）：425-449.

［3］ Hilder V A，Gatehouse A M R，Sheerman S E，et al.A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco ［J］.Nature，1987（330）：160-163.

［4］ Xu D P，Xue Q Z，Mcelroy D，et al.Constitutive expression of a cowpea trypsin inhibitor gene CpTI in transgenic rice plants confers resistance to two major rice insect pests［J］.Mol Breeding，1996（2）：167-172.

［5］ Lanza A，Tava A，Catalano M，et al.Effects of the Medicago scutellatatrypsin inhibitor（MsTI）on cisplatin-induced cytotoxicity in human breast and cervical cancer cells［J］.Anticancer Res，2004（1）：227-233.

［6］ 李 健，王志農，紀廣玉，等.尿胰蛋白酶抑制劑對體外循環心臟手術患者血漿內毒素水平及全身炎性反應的影響［J］.解放軍醫學雜志，2009（8）：1005-1008.

［7］ 楊莉莉，賀巾超，董 文，等.重組牛胰蛋白酶抑制劑對大鼠胰腺炎的治療作用［J］.中國藥師，2008（4）：375-377.

［8］ 丁安林，王 雁，常汝鎮.大豆的抗營養因子及其改良［J］.大豆科學，1994（1）：72-76.

［9］ Hilder V A，Gatehoues A M R，Boulter D.Transgenic plants conferring insect tolerance：proteinase inhibitor approach［C］.In：Kung S D，Wu R，eds.Transgenic Plants［A ］.New York：Academic Press，1993：317-338.

［10］ Feng G H，Richardson M，Chen M S，et al.α-Amylase inhibitors from wheat a sequences and patterns of inhibition of insect and human anα-Amylases［J］.Insect Biochem Mol Biol，1996（26）：419-426.

［11］ 陳少夫，山本光勝，大槻眞.蛋白酶抑制劑ONO-3403對胰泌素刺激的大鼠胰腺外分泌的影響［J］.世界華人消化雜志，2002（7）：792-795.

［12］ 張英杰，劉月琴，孫洪新，等.羔羊小腸pH及主要消化酶發育規律的研究［J］.畜牧獸醫學報，2005（2）：149-152.