奶牛支原體病的診斷

郭 磊，何生虎＊，邵 倩，楊萌萌，蔣魏娟，安泓霏，付少剛

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川750021；2.銀川市畜牧獸醫工作站，寧夏銀川750001）

牛支原體（Mycoplasma bovis）是一種能夠導致牛產生各種各樣疾病和高感染率的的重要病原體。它可以導致牛發生肺炎、關節炎、久治不愈乳腺炎、結膜角膜炎、懷孕母牛流產、生殖器感染等疾病［1］。發生牛支原體肺炎影響集約化牛場的生產，且常常由于高病死率、治療昂貴以及病牛生長緩慢而給奶牛養殖企業帶來巨大的經濟損失；美國每年由于牛支原體所致的牛乳房炎和呼吸系統疾病造成高達1.4億美元的損失，單一牛場最高感染率達70%［2-3］。在我國，1983年黎濟申首次報道了從乳房炎牛乳中分離得到牛支原體［4］，此后僅少數臨床報道證實了牛支原體導致奶牛乳房炎；2008年湖北多地報道了牛支原體可導致肉牛傳染性支原體肺炎［5］，2010年寧夏報道了肉牛傳染性支原體肺炎［6］。在奶牛方面，國內很少見有牛支原體感染的報道。2011年2月開始，寧夏吳忠某奶牛場中國荷斯坦奶牛出現發燒、咳嗽、鼻孔流有鐵銹色鼻液、腹瀉、關節腫大、蹄部炎癥、嚴重乳房炎、頭胎牛發生流產、死胎，新生犢牛在飼喂乳房炎奶牛的乳汁后，逐漸出現關節和蹄部腫大（圖1），行走困難，甚至無法站立等癥狀；經實驗室診斷，確診為牛支原體和牛無乳支原體混合感染，感染率約為35%，現報告如下。

圖1 患牛支原體的奶牛關節病理變化Fig.1 The pathological lesions in joints of cows infected with Mycoplasma bovis

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 無菌采集病、死奶牛血液、乳汁、鼻及氣管液、肺臟、肝臟、脾臟等。

1.1.2 主要試劑及儀器 新生牛血清購自廣東蕊特生物科技有限公司，酵母粉、瓊脂、水解乳清蛋白粉等均為美國BD公司產品，醋酸鉈為西安市金尊精細化工有限公司產品，青霉素為河北遠征藥業有限公司產品。BIOK-260牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒為比利時BIOK公司產品。Taq DNA聚合酶、pMD18-T為寶生物工程（大連）有限公司產品，Primer由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。藥敏片為北京天壇藥物生物技術開發公司生產產品，抗生素類產品標準：YZB／國1748-2006；喹諾酮類產品標準：YZB／國1725-2006。

Biorad-680全自動酶標儀，My Cycler PCR儀，均為美國Biorad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 流行病學調查 主要以養牛頭數、發病情況、發病率、病死率、臨床癥狀及病理變化觀察等內容為主。

1.2.2 病原體分離培養 將無菌采集發病奶牛的氣管液、乳汁和關節液樣品接種改進的Hayflick支原體液體培養基［7］，置37℃恒溫培養箱內靜置培養4d～6d，待培養基顏色變黃后將培養物連續傳代。將穩定傳代的培養物接種于支原體固體培養基上，置37℃、體積分數為5%的二氧化碳培養箱中培養2d～6d，待菌落長出后，觀察菌落形態。

1.2.3 血清學檢測 按照BIOK-260牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒說明書對10頭發病奶牛采集血清進行稀釋、血清轉換、反復沖洗等步驟，制備出試驗所需的微量板，配合美國Biorad 680全自動酶標儀在450nm波長下讀取每孔的吸光度值，比照BIOK-260牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒說明書，計算出校驗值（Val），根據0（Val＜11.40）、＋（11.40＜Val＜44.64）、＋ ＋ （44.64＜Val＜77.89）、＋＋＋（77.89＜Val＜111.14）、＋＋＋＋（111.14＜Val＜144.39）、＋ ＋ ＋ ＋ ＋ （Val＞144.39）判定樣品陰性或陽性的強弱。

1.2.4 牛支原體PCR檢測

1.2.4.1 支原體核酸的提取 據文獻提取方法，從固體培養基上將一小塊帶有支原體的菌落挑取加入到150mL滅菌水的離心管中，煮沸10min，之后冰浴1min，12 000r／min離心45s，取上清液作DNA模板。

1.2.4.2 引物的設計與合成 根據相關文獻報道支原體16SrRNA兩端的保守序列、序列特性，設計支原體通用引物，通過PCR方法擴增培養產物中的16SrRNA［8-9］。

上游引物：5′-AAAATGAGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′； 下 游 引 物：5′-CCTTGTTACGACTTCACCCCAATC-3′，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，預計擴增目的片段的長度為1.5kb左右。

1.2.5 支原體16SrRNA基因的擴增 擴增體系：根據相關文獻采用25μL反應體系，其中包含10×PCR buffer 2.5μL，Mg2＋1.5μL（25mmol／L），dNTP 0.6μL（10mmol／L），TaqDNA 聚合酶0.3 μL（5U／μL），DNA模板2μL，重蒸水15.2μL，上游和下游引物各1μL（25μmol／L）。

PCR擴增參數：94℃5min；94℃1min，50℃1min，72℃90s，30個循環；72℃ 10min。預期PCR產物大小為1.5kb。擴增產物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將目的條帶用DNA回收試劑盒回收。

1.2.6 支原體16SrRNA基因的測序 將PCR產物克隆到質粒pMD18-T中，委托寶生物工程（大連）有限公司進行基因序列測定。最后將以上測得的序列與GenBank中的標準序列進行比較，挑出經BLAST軟件比對同源性最高的序列，確定其類型。

1.2.7 藥敏試驗 利用藥敏紙片法對所分離的病原體進行藥敏感試驗，所用藥敏試紙的種類為β-內酰胺類：氨芐青霉素、頭孢西丁、苯唑西林；氨基糖苷類：阿米卡星；大環內酯類：紅霉素、克林霉素；四環素類：多西環素、四環素；喹諾酮類：氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星；以及氯霉素。支原體藥敏試驗的培養條件同支原體分離培養，根據抑菌圈直徑大小判斷藥物敏感性，判斷標準參照產品說明。

2 結果

2.1 流行病學調查結果

自2011年2月開始，該奶牛場部分泌乳牛突然出現精神沉郁，食欲不振（后廢絕），體溫39.5℃～40.5℃，場內技術人員采用青霉素鉀、頭孢西丁、四環素類抗生素和中藥柴胡等進行治療，基本無效，1周后該牛被淘汰。自2月以來，個別牛只開始表現鼻鏡干燥，陸續出現體溫升高到39.5℃～41℃，采食量下降，呼吸急促，劇烈干咳，特別在采食后和清晨尤為明顯，瘤胃蠕動音基本消失，胸部聽診有哨樣啰音，有的牛只出現鐵銹色鼻液，黏性膿性鼻液，眼部有分泌物，繼續使用止咳類和β-內酰胺類、氨基糖苷類抗生素藥物治療，效果不佳。到5月奶牛發病頭數逐漸增多，泌乳牛群中個別圈舍奶牛陸續出現上述呼吸道癥狀，有的甚至出現急性病癥，突然瘋跑，栽倒死亡，乳房炎牛只數量急劇增加，抗生素治療效果不佳，治愈率低，且反復發生率高，頭胎牛發生流產、死胎；新生犢牛在飼喂乳房炎奶牛的乳汁后，逐漸出現關節和蹄部腫大，行走困難，甚至無法站立，精神狀態極差，并伴有腹瀉等癥狀。自2月至6月以來總計因上述病癥死亡牛只10頭，犢牛發病16頭，牛群整體狀況不良。針對上述情況，對發生肺炎癥狀、發燒、關節炎、以及嚴重乳房炎，習慣性流產的成年奶牛和犢牛均建立“癥候圈”單獨隔離，治療觀察。

剖檢病死奶牛可見皮下呈膠凍樣，病理變化主要在胸腔內，肺腫大，大部分肉樣變，縱切可見大理石樣花紋（圖2），肺部和胸膜有粘連，胸腔內有少量積液。剖開心包，可見心內膜腐爛，呈肉芽樣（圖3），有積液，液體為黃色澄清樣。腹腔內有大量橙黃色腹水，肝臟腫大呈灰白色，膽囊腫大，脾臟邊緣鈍圓。子宮內積有大量灰白色惡臭濃汁，子葉脫落。下頜淋巴結、肺門淋巴結、髂下淋巴結腫大。切開關節腔有黃色半透明膿血樣的渾濁液體。

圖2 患牛支原體肺炎的奶牛肺部病理變化Fig.2 The gross pathological lesions in lungs of dairy cow infected with Mycoplasma bovis

圖3 患牛支原體病奶牛的心臟病變Fig.3 The pathological lesions in heart of dairy cow infected with Mycoplasma bovis

2.2 病原體的分離培養

接種于改良的Hayflick支原體液體培養基病料，在傳至第3代后培養基的顏色由渾濁橙黃色逐漸變為澄清、透明的淡黃色；接種普通營養瓊脂血液培養基上的病料經37℃、體積分數為5%的二氧化碳環境下恒溫培養24h后觀察其表面無菌落生長；接種于支原體固體培養基經約72h培養后，表面出現突出于支原體培養基表面，呈油煎蛋樣菌落（圖4），挑取較小的單個菌落接種于支原體液體培養基，經37℃、體積分數為5%的二氧化碳環境下恒溫培養72h，培養基顏色變黃且澄清、透明。挑取“煎蛋樣”菌落抹片，姬姆薩染色后觀察到支原體形態呈現多形性，有的形似戒指，多數呈“豆芽樣”（圖5）。

圖4 病料在支原體瓊脂培養基上的生長菌落Fig.4 The colonies of pathogens on Mycoplasmaagar medium

圖5 姬姆薩染色后的支原體形態Fig.5 The form of Mycoplasmaafter Giemsa staining

2.3 血清學檢測結果

經酶標儀讀數根據說明書公式Val=delta OD sample×100／delta OD positive，所得數值均大于11.40，依照說明書，大于11.40者即為陽性（＋），對檢測的10份牛血清進行判定，其中“＋”3頭、“＋＋”6頭、“＋＋＋”1頭。

2.4 16SrRNA基因的PCR擴增結果

16SrRNA基因的PCR擴增產物經1g／L的瓊脂糖凝膠電泳，獲得1.5kb的目的條帶，空白對照未見任何條帶出現，與預期的擴增長度相符（圖6）。

2.5 支原體16SrRNA基因的序列

對16SrRNA擴增產物進行測序分析，上網利用BLAST軟件進行序列同源性比較，結果表明所分離支原體為牛支原體（Mycoplasmabovis），與GenBank中牛支原體16SrRNA序列CP002513.1（MycoplasmabovisHubei-1，complete genome）的同源性為99%，與無乳支原體CU179680.1（MycoplasmaagalactiaePG2chromosome，complete sequence）同源性為99%。

圖6 牛支原體PCR擴增結果Fig.6 PCR amplification results of 16SrRNA of Mycoplasma bovis

2.6 藥敏試驗結果

整體說來，該支原體耐藥性較為嚴重，和多數報道四環素類藥物療效較好不一致。因此不同牛場分離的牛支原體藥敏特性有較大差異，本試驗中阿米卡星和環丙沙星應為首選藥物（表1）。

表1 牛支原體藥敏試驗Table 1 Drug sensitivity test of Mycoplasma bovis

3 討論

經過近3個月對該病原體的系統研究，確定該地區本次流行的病原為牛支原體和無乳支原體。該病在寧夏地區奶牛為首次流行。據文獻記載，1961年牛支原體被鑒定為致牛乳房炎的病原［2］；1976年被描述為導致牛呼吸道疾病的病原［10］。此后，不同國家都有該病的流行［11］。目前，牛支原體已被認為是肉牛、奶牛和犢牛發生呼吸道疾病與多發性關節炎的重要病因。牛支原體既可以導致牛的急性傳染性呼吸系統疾病，還可導致持續感染和慢性支氣管肺炎以肺干酪樣或凝固性病理特征的壞死病變［5］。牛支原體經常和細菌、病毒協同，環境因素如天氣、通風不良、過度擁擠、運輸等將加劇病情，加之不良的用藥習慣使一些耐藥性細菌的存在，因此臨床上對多種抗生素的治療效果很差，甚至無效［11］。本次牛支原體病流行的背景支持以上觀點。本次流行中，發病奶牛均為犢牛與青年牛，經調查此次牛支原體肺炎是由于隔壁某牛場盲目引進奶牛，未經嚴格檢驗檢疫，加之長途運輸時氣候變化明顯等多種促發因素，使病情復雜化。據文獻記載，患病牛只可通過鼻腔分泌物排出牛支原體，健康牛只可通過近距離接觸病牛而獲得病原，感染發病。一旦感染，可持續攜帶病原而成為其他健康牛只的傳染源。牛支原體在自然環境中存活能力差，但在無光照情況下可存活數天，例如在4℃的海綿中或牛奶中可存活2個月之久，20℃存活1周到2周，37℃存活1周，糞中可存活37d［5］。傳統的消毒劑均可達到消滅該病原的目的。牛支原體雖然可引起肉牛、奶牛與羊的感染，但目前尚無可感染人的報道。犢牛發生支原體關節炎的主要原因是犢牛飲用了乳房炎患病奶牛的乳汁。發生牛支原體感染奶牛的牛乳中同樣存在著牛支原體病原，本次試驗中從病牛乳汁中分離出病原體；該場將患病奶牛的乳汁飼喂犢牛，造成新生犢牛的整體暴發牛支原體性關節炎，就充分證明這一點。

本試驗從病牛肺部組織、乳汁中分離獲得的病原，采用支原體通用引物進行PCR 16SrRNA擴增與鑒定，Takahiro Matsuki等學者認為當病原的16S rRNA基因可變區序列同源性大于97%時，便可認為這些病原是屬同一種［12-13］，細菌分類學家普遍認為，如果兩個16SrRNA序列同源性低于97%，可以認為是屬內不同類型的種。由此為依據，本試驗利用分子生物學方法對誘發奶牛纖維素性肺炎、久治不愈的乳房炎、關節炎的支原體16SrRNA擴增，測序，與GenBank中的標準序列進行比較，挑出經Blast軟件比對同源性高達99%的序列，得到了牛支原體和無乳支原體，確定了病原類型。

藥敏試驗效果不佳，經分析主要與該牛場用藥習慣和牛群對抗生素的耐藥性有關。結合相關文獻，不同牛場分離的牛支原體藥敏特性有較大差異，所以藥敏試驗的結果不一致。針對本次牛支原體的流行建議選用阿米卡星、環丙沙星，在防治中起到了一定的效果。另據報道早期使用泰樂菌素類（泰樂菌素、替米考星、瑞可新）及泰妙菌素類抗菌藥（支原凈、沃尼妙林）也有一定效果［11］。

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