16種中藥對水貂綠膿桿菌的體外抑菌試驗

張傳美，劉海生，楊海燕，楊瑞梅，秦志華，單 虎

（青島農業大學動物科技學院，山東青島266109）

綠膿桿菌（P.aeruginosa）或稱銅綠色假單胞菌，為假單胞菌屬（Pseudomonas）成員，是臨床上較常見的條件致病菌之一，可引起各種繼發或混合感染，亦可作為原發性病原引起水貂、家禽、兔、羊等動物發病。近幾年來，隨著養貂規模的擴大，臨床上由綠膿桿菌引起的水貂出血性肺炎日益增多。綠膿桿菌具有多重耐藥的特性，加之臨床上抗生素的濫用，綠膿桿菌耐藥的問題日益嚴重［1］。因此，獸醫臨床急需尋找低毒有效的抗生素的替代品，以控制疾病的發生。許多研究表明，中藥或天然植物提取物，可發揮對病原菌直接殺滅作用或提高機體免疫力達到防治疾病的目的［2-3］。為此，本試驗對五味子等16種中藥，通過抑菌試驗研究其對綠膿桿菌標準株和分離株的抑菌效果，旨在篩選出對綠膿桿菌有抑菌作用的藥物，指導臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥 五味子，訶子，五倍子，石榴皮，烏梅，黃芪，太子參，金銀花，連翹，黃連，射干，穿心蓮，貫眾，大黃，蒼術，丁香。每味藥50g，均購自青島市城陽區同仁堂藥店。

1.1.2 菌種 綠膿桿菌標準株ATCC27853為山東省農業科學院惠贈；分離株為山東省預防獸醫重點實驗室從臨床發病水貂分離鑒定保存。

1.1.3 培養基 LB液體培養基，普通營養瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養 取冰箱中的綠膿桿菌標準株和分離株的菌種用普通瓊脂培養，接種后置于37℃培養箱中培養，待菌種復壯后接種于LB液體培養基。培養6h后，按照1∶10 000稀釋。

1.2.2 藥液的制備 取16種中藥各50g，浸泡30min，取各藥分別水煎2次后濃縮。生藥含量為1 000mg／mL，然后進行倍比稀釋。滅菌后置冰箱備用，具體方法參見文獻［4］。

1.2.3 抑菌試驗 采用瓊脂平板打孔法［5］，普通營養瓊脂20mL傾注入直徑9cm的平皿內，凝固后其厚度為4mm～5mm，用移液槍吸取200μL的細菌稀釋液，均勻涂布于瓊脂表面，待菌液被吸收后，用直徑為6mm的無菌打孔器均勻打孔，5孔／板。孔間距大于20mm，依次滴加中藥倍比稀釋液，中間孔加入滅菌蒸餾水作對照。以剛剛注滿為準，每種中藥作2個重復。將平板37℃培養12h～18h后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。以2孔的平均值表示該中藥的抑菌作用大小。

1.2.4 判斷標準 抑菌效果判定標準均按《中藥藥理學》標準即：抑菌圈直徑＜10mm為耐藥（-）。10mm～15mm為中度敏感（＋），15mm以上為高度敏感（＋＋）。

2 結果

2.1 16種中藥對綠膿桿菌標準株的抑菌效果

采用打孔法測定了16種中藥對綠膿桿菌標準菌株的抑菌圈直徑，結果見表1。由表1可見，五倍子對綠膿桿菌標準株的抑菌效果最好，1 000 mg／mL濃度的藥液抑菌圈直徑達26.5mm。五味子和訶子也有較好的抑菌作用，1 000mg／mL濃度抑菌圈直徑達23.5mm。其次為石榴皮、烏梅和黃連，對綠膿桿菌標準株也有一定抑菌作用。射干、連翹和金銀花抑菌效果較差，抑菌圈直徑均小于10 mm。穿心蓮、貫眾、黃芪、太子參、大黃、蒼術、丁香7味中藥各稀釋度對綠膿桿菌標準株抑菌圈直徑均為0，無抑菌作用（在表1中未列出）。

表1 16種中藥對綠膿桿菌標準株的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of 16kinds of traditional Chinese medicines on standard strains of P.aeruginosa

2.2 16種中藥對綠膿桿菌分離株的抑菌效果

采用打孔法測定了16種中藥對綠膿桿菌分離菌株的抑菌圈直徑，結果見表2。由表2可見，訶子對綠膿桿菌分離株的抑菌效果最好，1 000mg／mL濃度的藥液抑菌圈直徑達24mm。其次為五倍子和五味子，1 000mg／mL濃度的藥液抑菌圈直徑達21mm。黃連、石榴皮、烏梅、金銀花和連翹對綠膿桿菌分離株也有一定抑菌作用。大黃和射干抑菌效果較差，抑菌圈直徑均小于10mm。黃芪、太子參、穿心蓮、貫眾、蒼術、丁香6味中藥各稀釋度對綠膿桿菌分離株抑菌圈直徑均為0，無抑菌作用（在表2中未列出）。

表2 16種中藥對綠膿桿菌分離株的抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of 16kinds of traditional Chinese medicines on separation strains of P.aeruginosa

3 討論

水貂出血性肺炎是由綠膿桿菌引起的貂的一種急性敗血性傳染病，臨床表現為呼吸困難、咯血、死前鼻孔流出紅色泡沫性液體，剖檢病變主要在肺部，肺腫大，呈深紅色肝樣變，切開時流出大量血樣泡沫，肺門淋巴結腫大，氣管和支氣管黏膜呈桃紅色等。近年來，綠膿桿菌感染已漸趨增多，且耐藥菌株不斷增加。因此，從天然藥物中尋找高效的抗菌藥物就更顯重要。五倍子、五味子、訶子、石榴皮和烏梅5味中藥均為斂肺澀腸藥，具有斂肺止咳、生津斂汗、澀腸止瀉的功效［6］，故用五倍子等收澀藥來治療水貂的出血性肺炎符合中醫治療疾病的理論［7-8］。本試驗證明五倍子、五味子、訶子、石榴皮和烏梅5味中藥對綠膿桿菌有相當好的殺菌效果，其中五倍子、訶子和五味子中藥在濃度很低的情況下，也會對綠膿桿菌產生抑菌效果，并且中藥還不易產生耐藥性，這些都為臨床上中藥治療水貂綠膿桿菌病提供強有力的科學依據［9］。試驗藥物中，黃連、金銀花、連翹和射干等清熱類中藥也有一定抑菌效果，黃芪和太子參等補益類中藥以及穿心蓮、貫眾、蒼術、丁香和大黃均無抑菌作用［10］。這表明補益類藥物的抑菌作用不如清熱解毒類藥物。此試驗與陳娟等［11］的試驗結果相似。本試驗僅通過抑菌試驗對16種中藥的藥效進行比較，究竟療效如何，還有待于實際臨床進一步驗證。

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