一株豬源豕鏈球菌的分離鑒定

陳 煜，吳 達，孫 敏，王楷宬，鄧明俊，吳振興，岳志芹，鄭小龍，孫 濤，肖西志＊

（1.福建農林大學生命科學學院，福建福州350002；2.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅蘭州730020；3.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島266002；4.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島266032）

鏈球菌科包括2個屬，鏈球菌屬和乳球菌屬，鏈球菌屬包括89種鏈球菌，豕鏈球菌和豬鏈球菌同屬于鏈球菌屬。Collins于1984年將豕鏈球菌歸入蘭氏血清群E、P、V、U以及其他3個抗原群，即C1、5916T和7155A，豕鏈球菌的模式株包括NTCC10999、SS-1029和 ATCC43138［1］。而豬鏈球菌的血清群包括C、D、E和L群，在血清學上兩者可能存在交叉反應。兩者在生長表現及形態學上非常相似，即在血瓊脂平板上菌落都為光滑、圓潤的呈現明顯的β型溶血，在普通光學顯微鏡下，經革蘭染色后都表現為革蘭陽性、長短不一的球菌。

據報道，豕鏈球菌通常與豬的化膿性感染有關，如子宮頸淋巴管炎、膿腫、肺炎、敗血癥和心內膜炎［2］。有報道稱該菌可引起豬流產［3-4］。據報道從健康豬也能分離到該菌［5］。從女性的生殖系統可分離到該菌［6］，作為致病菌，主要感染女性的生殖系統［7］，可引起死胎［8］。也有該菌引起皮膚外傷感染的報道［9］。通過對25株分離自人的豕鏈球菌與17株參考菌株的比較分析，結果顯示人源豕鏈球菌與豬源有明顯的差異［10］。Bekal S等［11］利用16SrRNA 測序分析表明，人類的豕鏈球菌在生化特點上與來源于豬的豕鏈球菌雖然相同，但分子生物學上存在差異，從而將人類的豕鏈球菌命名假豕鏈球菌（Streptococcus pseudoporcinus）。Kevin A S等［12］通過流行病學調查發現假豕鏈球菌主要存在于黑人女性中，而且與其他生殖道疾病相關。我國關于豕鏈球菌的報道很少，僅見有陳明輝的牛源豕鏈球菌的生物學特性報道［13］。

山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心近期對送檢的一例病死豬進行了針對豬鏈球菌病的檢測，綿羊血瓊脂上分離到疑似豬鏈球菌菌株，菌株呈明顯的β型溶血。為進一步的確證該菌，我們進行了生化、血清學和分子生物學鑒定，同時我們進行了小鼠感染試驗以確認其是否具有致病性。

1 材料與方法

1.1 材料

綿羊血瓊脂平板為OXOID公司產品；VITEK革蘭陽性鑒定卡、鏈球菌乳膠凝集分型診斷試劑盒為法國梅里埃公司產品；豬鏈球菌分型血清為中國動物衛生流行病中心豬病實驗室提供；細菌鑒定卡和藥敏鑒定卡為美國BD公司產品；豬鏈球菌通用型、1型、2型、7型和9型特異性引物由農業部動物衛生與流行病學中心提供；清潔級試驗小鼠購自青島食品藥品管理局實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病料的分離培養 無菌采集死豬的桿、心、脾、肺、腎、扁桃體等組織，分別研磨，然后接種于綿羊血瓊脂平板，37℃，24h，挑取明顯β溶血、表面光滑、透明菌落，進行革蘭染色鏡檢。對可疑菌落用綿羊血瓊脂平板進行純培養。

1.2.2 可疑菌的生化鑒定 取可疑菌的純培養物分別按照VITEK2（法國梅里埃微生物鑒定系統）和PHOENIX-100（美國BD公司微生物鑒定系統）配制菌懸液。

1.2.3 血清學鑒定 首先用鏈球菌分群血清進行分群，然后用豬鏈球菌的分型血清（35種）進行分型，分群血清采用的是乳膠凝集試驗，分型則應用玻片凝集試驗。

1.2.4 PCR鑒定 采用豬鏈球菌通用型引物及1型、2型、7型和9型特異性引物對純培養物的核酸提取物進行擴增，同時設立陽性對照和陰性對照，所用引物序列見表1。

1.2.5 16SrDNA的擴增及序列測定 用豬鏈球菌16SrDNA的通用引物27F和1492R對分離的純培養物核酸進行擴增，序列見表1。PCR產物經瓊脂糖凝集回收試劑盒回收后送南京金斯瑞生物公司測序，測序結果在NCBI中的GenBank進行比對。

1.2.6 小鼠感染試驗 將分離菌株接種于血清肉湯，37℃，12h后離心，沉淀用生理鹽水稀釋到1×106cfu／mL，腹腔注射小鼠4只，同時設生理鹽水作為對照。

2 結果

2.1 分離株的生長表現

分離到的可疑菌株在綿羊血瓊脂平板上37℃培養12h后表現為圓形、光滑、透明的小菌落，呈β溶血；在血清肉湯中為試管底部有輕微的渾濁沉淀。

2.2 生化試驗鑒定

經PHOENIX-100和VITEK2微生物鑒定儀鑒定，結果均為豕鏈球菌。可信值分別為99%和97%，結果見表2和表3。

表1 所使用的引物及目的片段大小Table 1 Primers and size of target sequences

表2 可疑菌的PHOENIX-100生化試驗鑒定結果Table 2 Identification result of suspect bacterium by PHOENIX-100

表3 可疑菌的VITEK2生化試驗鑒定結果Table 3 Identification result of suspect bacterium by VITEK 2

2.3 血清學分型

用鏈球菌乳膠凝集法檢測試劑盒（可檢測鏈球菌A、B、C、D、F和G群）對分離到的可疑菌的分群結果顯示，6種分群血清均不能與分離到的可疑菌株凝集。同時，32種豬鏈球菌分型血清也不能與可疑菌凝集。

2.4 PCR鑒定結果

用豬鏈球菌通用引物及豬鏈球菌的1、2、7、9型特異性引物對可疑菌提取的基因組DNA的擴增結果顯示均沒有目標條帶出現，對照組試驗結果成立，結果見圖1和圖2。

圖1 可疑豬鏈球菌的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of suspect S.suis

圖2 分別用豬鏈球菌通用引物及1型、2型、7型和9型對可疑菌進行PCR鑒定Fig.2 PCR identification of suspect bacterium amplified by general primers of S.suis，1，2，7and 9respectively

2.5 16SrDNA序列比對及與豬鏈球菌的同源性分析

細菌16SrDNA的通用引物27F和1492R對可疑菌的核酸提取物擴增出1 500bp左右的目標條帶，對擴增產物的序列表明，與發表的豕鏈球菌具有98%的同源性，而與豬鏈球菌2型的同源性為93%。

2.6 攻毒試驗結果

試驗組小鼠在注射可疑菌的菌懸液后沒有出現明顯的發病癥狀，和對照組小鼠在表現上無明顯差異，經1周后仍正常。

3 討論

隨著分子生物學技術的發展，鏈球菌屬的分類已經從21種［14］增加到89種［1］，那些以前未被分離到或誤判為某種鏈球菌的鏈球菌屬新成員被重新命名并定位。這也意味著一些新的病原體被發現并逐漸受到重視。

雖然VITEK2和PHOENIX-100的鑒定結果均為Streptococcus porcinus，兩者的可信度分別達到了97%和99%，但由于生化試驗的結果還不足以得出鑒定結論，甚至生化試驗有時會給出錯誤的結果［15］。因此，隨后的試驗有兩個目的，一是排除豬鏈球菌；二是對該菌進行鑒定及致病性的初步分析。

豕鏈球菌和豬鏈球菌在形態學及生長表現上很相近，在血瓊脂上都呈現明顯的β型溶血。然而這兩種菌在致病性方面具有很大差別，豬鏈球菌是一種重要的人畜共患細菌性傳染病，不僅可給養豬業帶來重大損失，而且人一旦感染也會引起發病甚至死亡。因此，當我們分離到疑似豬鏈球菌時，所設計的試驗都是按照豬鏈球菌標準進行。

所分離的豕鏈球菌的血清學分群結果與Christian等的報道結果相同，暗示著所分離的豕鏈球菌并不是醫學中常見的B型，有可能是E、U、V、P中的一種，還需要進一步確認。用豬鏈球菌分型血清進行的凝集試驗和隨后的針對豬鏈球菌的PCR鑒定結果排除了豬鏈球菌的可能。

16SrDNA作為細菌分類的活化石，已經廣泛應用于細菌的分類和鑒定［16-23］，并以此開發出許多快速的鑒定方法［24-27］。根據 Bosshard P P［28］的判斷標準，16SrDNA的同源性在95%～99%之間的可認為是同屬細菌，大于99%的可認為是同種細菌。因此，通過生化鑒定和分子生物學鑒定，可確定所分離到的鏈球菌為豕鏈球菌。

本研究的結果表明，雖然所分離到的豕鏈球菌不具備致病性或具有較弱的致病性，但解剖及試驗分析表明，該菌可存在于健康豬體內，并可能會成為繼發感染的病原體之一，應引起重視。

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