哺乳類動物胃腸道內味覺受體的信號研究

陳曉慧，張春雷，陳 宏＊，2，房興堂

（1.江蘇師范大學細胞與分子生物學研究所，江蘇 徐州221116；2.西北農林科技大學動物科技學院/陜西省農業分子生物學重點實驗室，陜西 楊凌712100）

胃腸道是腔內營養或非營養的化學物質、微生物、藥物、毒素等各種信號分子的感覺器官。我們通常以胃腸細胞來檢測腔內的物質是如何啟動激素和神經系統的信號通路，最終達到調控營養物質的消化和吸收，食物的攝取量，胰島素的分泌及新陳代謝等一系列機能反應。到目前為止，有關于胃腸腔內不同化學成分的分子識別機制還沒做過完整的闡述。在此，我們就來闡述口腔內味覺識別的分子信號通路和胃腸細胞的化學感應機制。這些新的研究結果可以為臨床醫療和動物的飼養管理提供參考，特別是由腔內的化學敏感引起的食欲不振和代謝紊亂疾病。

1 胃腸道內味覺受體基因家族的表達

我們已經知道，苦味受體基因家族taste receptor，type2（T2Rs）在人和嚙齒類動物的口腔味蕾受體細胞中表達［1－3］。這些味覺受體屬于G蛋白偶聯受體（GPCR）超家族，是由一條多肽形成的7次跨膜螺旋結構，有3個胞內環和3個胞外環。味覺受體第一 家 族 taste receptor，type1，［T1Rs（T1R1、T1R2、T1R3）］也屬于G蛋白偶聯受體超家族，它們是甜味劑和 L－氨基酸的受體［4，5］。小鼠和大鼠的taste receptor，type2（T2Rs）基因家族由36個完整的基因和至少7個假基因組成，它們分別位于小鼠的2、6、15號染色體上，大鼠的2、3、4號染色體上［6］。人類的T2R基因家族由33個成員組成，至少24個基因編碼，分布在第5、7、12號染色體上［7］，揭示在不同的動物中，T2Rs位于不同的染色體上。T2Rs各成員之間僅有30%～70%序列相似度。雖然它們的序列相似度較低，但在第1～3、第7跨膜區和第2胞內區具有高度保守的序列［2］。T2R基因家族各成員在不同物種中的序列相似度更低，對小鼠和人的T2Rs的研究發現，在位于第5跨膜區且靠近第3胞內區的1個氨基酸殘基是完全保守的［8］。進一步的研究發現，T2Rs結構中，跨膜區保守性最高，其次是胞內區，而胞外區的變異性最高，所以我們推斷胞內區和其臨近的跨膜區是與G蛋白相互作用的位點，胞外區是與苦味物質結合的區域［2，9，10］。這一基于序列的推斷被后來的功能實驗所驗證。

我們從小鼠、大鼠的肝臟、心臟、腎臟、腦組織和IEC－6/IEC－8細胞系中提取的 RNA，經過實時定量PCR檢測后發現，T2Rs在這些組織中均未表達，但在胃腸道粘膜中均表達［11］。最新的研究發現，在人的結腸中表達 T2Rs，包括 T2R3、T2R4、T2R5、T2R10、T2R13、T2R38、T2R39、T2R40、T2R42、T2R43、T2R44、T2R45、T2R46、T2R47、T2R49、T2R50、T2R60［12］。目前，hT2Rs有些受體的配基已經被鑒別出來了，比如，denatonium benzoate偶聯在hT2R47位點上，士的寧偶聯在hT2R10位點上，水楊苷偶聯在hT2R16位點上［13］，其他苦味物質的偶聯位點仍需進一步探究。小鼠、大鼠和人腸道內的T1R1、T1R3以異源二聚體的形式識別L－氨基酸，T1R2、T1R3以異源二聚體的形式識別甜味物質［14－16］。這些研究結果都證明了，甜味、苦味、L－氨基酸受體在小鼠、大鼠和人的腸道內均表達。

2 小鼠、大鼠和人胃腸道細胞中α－味導素Ga和轉導素Gat－2的表達

基因學和生物化學方面的證據表明，G蛋白的α亞基即α－味導素Ga對T1Rs、T2Rs的信號識別起著重要作用［17］。除了舌上皮組織外，Ga在胃［11，18］、腸［11，19］、胰腺細胞［11，20］中也有表達，表明味覺感 受機制也存在于胃腸道內。通過原位雜交方法確認，編碼Ga的mRNA存在于小鼠和大鼠整個胃腸系統的粘膜中［11，16，21］。

與味覺信號轉導有關的轉導素Gat－2在胃腸粘膜中表達［6，11］。嚙齒類動物胃腸粘膜轉導素 Gat－2陽性細胞的分布和形態與Ga的陽性細胞不同［11］，表明Ga和轉導素Gat－2也許在小鼠和大鼠胃腸道不同類型的上皮細胞中表達［6，11］。

3 胃腸道內分泌細胞Ga的表達

Ga－gust免疫反應性細胞存在于人胃腸道的各個細胞，同時，我們還得知，Ga在腸內分泌細胞中表達，在其他的腸上皮組織中不表達，說明了Ga－gust是在人胃腸道的內分泌細胞中揮作用［12，16，22］。胃腸道的內分泌細胞占腸上皮組織的量不到1%，但是它們組成了人體最大的內分泌器官，產生和分泌多種激素［23］。開放型的腸內分泌細胞對腔內信號分子的識別是通過基底側胃腸激素的分泌來完成的。比如，胃腸內分泌L細胞，多位于小腸和結腸處，產生和分泌腸肽激素PYY、胰高血糖素GLP－1。對Ga陽性細胞進行免疫反應性，發現也存在PYY和GLP－1。PYY 和 GLP－1 可 以 調 節 食 物 的 攝 取量［24，27］。除此之外，我們還檢測到 Ga與膽囊收縮素CCK共定位于胃腸內分泌I細胞中，CCK可以調節胃腸的蠕動和食物的攝取量。后來的研究同樣也證實了，Ga與GLP－1、抑胃多肽GIP共定位于小鼠和人的十二指腸內分泌L細胞中［28，29］。

4 腸內分泌細胞系中與味覺識別有關的因子的表達

培養的細胞系已經廣泛地應用于研究腸細胞的功能、信號通路。通過RT－PCR和序列分析，證明了在腸內分泌細胞系STC－1中表達T2Rs、Ga－gust、磷脂酶Cβ2（PLCβ2）、瞬時受體電位 M5（TRPM5），這些信號轉導分子都與舌上皮細胞的味覺感知有關［6，11，30］。最近的研究表明，小鼠的腸內分泌細胞系GLU Tag也表達特異性味覺信號因子［16］，大鼠的胰腺腫瘤細胞系 AR42J中也表達T2Rs、Gagust、Gat－2［6］。因此，小鼠的腸內分泌細胞系STC－1、GLU Tag、大鼠的胰腺腫瘤細胞系AR42J為研究信號通路提供了好的模式系統。

人的腸內分泌細胞系 HuTu－80、NCI－H 716中Ga－gust與特異性味覺受體共表達［12］。HuTu－80細胞系表達hT1R3，h T2Rs，包括h T2R38。NCI－H 716細胞系表達 Ga－gust、h T2R38、T1R1、T1R2、T1R3、TRPM5［22］。事實上，腸內分泌細胞系STC－1、GLU Tag、HuTu－80、NCI－H 716表達味覺信號通路中的多個因子，說明了胃腸道內分泌細胞對腔內容物的化學成分的感知起到重要作用。

5 胃腸道細胞中苦味信號轉導通路

有關口腔內味覺的信號通路已經很清楚了。例如苦味的識別，苦味劑與T2Rs特異性配對后，G蛋白就和受體偶聯，引發信號的轉導。此過程會有2條轉導通路：一種是受體和配體結合后激活Ga，活化磷酸二酯酶PDE，水解cAMP，解除了環核苷酸（cNMP）對離子通道的抑制，Ca2＋濃度升高，導致膜去極化和神經遞質的釋放。另一種是受體和配體結合后，G蛋白的βγ亞基分離，激活磷脂酶β2（PLCβ2），PLCβ2把磷脂酰肌醇－4，5－二磷酸［PI（4，5）P2］水解成二三磷酸肌醇（IP3）和二脂酰甘油（DAG），IP3和特異性受體結合后，Ca2＋濃度升高，導致膜去極化和神經遞質的釋放［9］。

有關胃腸道內分泌細胞的苦味、甜味信號轉導通路還沒有完全弄清楚。最初的研究發現，當STC－1、HuTu－80、NCI－H 716、AR42J細胞受到苯酸芐銨酰胺（DB）、苯基硫脲（PTC）、cycloheximide（CYX）等苦味劑的刺激后，細胞內Ca2＋濃度明顯升高［6，11，12，30，31］，所 以 我 們 就 推 斷，口 腔 內 特 異 性 味 覺的信號通路在內分泌細胞中也發揮作用。

L型電壓敏感性Ca2＋通道（VSCCs）能介導細胞外Ca2＋流入神經元和神經內分泌細胞，使細胞去極化［32］。當有 L－VSCCs的阻斷劑nitrendipine和diltiazem時，由DB、PTC、CYX等苦味劑刺激細胞時，Ca2＋濃度并沒有升高，說明了STC－1細胞內Ca2＋濃度升高是由開放型的 L－VSCCs介導的［30］。而在不表達T2Rs和G蛋白的多細胞系中，當受到DB、PTC、CYX等苦味劑刺激后不能引起細胞內Ca2＋濃度升高［6，11，12，30］。不同的苦味劑和各自特異性的苦味受體結合后可能會引起不同的信號通路。

6 甜味、苦味劑誘導胃腸道多肽類的釋放

我們現在推斷，甜味、苦味劑使胃腸內分泌細胞Ca2＋濃度升高，引發了CCK、PYY、GLP－1多肽類物質的釋放，這些多肽類物質刺激了局部的神經中樞的條件反射和（或）迷走輸入通路，激活了胰腺β細胞等周圍目標細胞的活性。

現在的研究主要集中在活體體內，對小鼠、大鼠進行不同的處理來驗證這些信號通路的正確與否。在給缺失Ga的小鼠填喂糖類物質時，血液中的GLP－1濃度并沒有升高，相反，這些小鼠的胰島素分泌受損，高血糖明顯［22］。除此之外，缺失 Ga或T1R3的小鼠，甜味受體的激活能夠激活Na＋/葡萄糖共轉運載體GLUT2的表達［16］。對小鼠的空腸灌注不同的甜味劑（包括人工合成劑）時，葡萄糖轉運載體GLUT2的表達量升高［15］。這些研究均表明了，味覺信號分子的識別能夠引起腸細胞對糖的吸收、調節胰島素的分泌等一系列生理生化反應。

7 小結和展望

口腔內味覺信號通路在胃腸道中也能發揮作用這一推斷，得到了大量實驗有力地證明。現在已經確定，特異的味覺分子轉導器，包括T1Rs、T2Rs、Gat－2、Ga－gust、PLCβ2、TRPM5在小鼠、大鼠、人的腸內分泌細胞系中表達。最新的研究發現，Ga－gust與GLP－1、PYY共定位于人和嚙齒動物粘膜的腸內分泌L型細胞中。大量的實驗顯示，甜味、苦味劑能夠引起培養的腸內分泌細胞分泌CCK、GLP－1、GIP胃腸多肽類物質。對小鼠進行空腸灌注甜味劑后，血液中的GLP－1濃度升高。而在缺乏Ga或T1R3的小鼠上沒有發現此類現象。

L細胞分泌的GLP－1、PYY和I細胞分泌的CCK使小鼠產生了厭食反應。GLP－1、PYY與食物攝取量的基本調控機制有關聯，也許也與由新陳代謝紊亂引起的疾病有關，例如II型糖尿病。GPCRs是目前許多治療藥物的靶目標，胃腸道細胞中與化學感應有關的GPCRs的鑒定、識別能為研究出新型的治療藥物提供新的思路。

目前關于味覺信號通路的研究都集中在小鼠、大鼠和人上，在牛等反芻動物上還未見相關報道。反芻動物氨基酸的營養需要研究一直以來就是個熱點和難點，難點主要體現在：反芻動物采食的氨基酸有一部分會被瘤胃微生物降解，并且其代謝和生產的氨基酸需要量受生理狀態和生產水平的影響，因此研究人員很難準確直接測定氨基酸的需要量；其次是，關于氨基酸的吸收和體內氨基酸平衡的調控機制還沒有完全搞清楚。而氨基酸在反芻動物生產性能的發揮中所起的重要作用又使得搞清楚氨基酸需要成為一個迫切的問題。動物機體存在氨基酸的快速識別系統，特別是T1R1和T1R3能以異源二聚體的形式在氨基酸的識別中發揮重要作用，所以，我們可以從體內氨基酸識別入手來研究反芻動物氨基酸的攝取與消化吸收的調控機制，從而為反芻動物飼料的營養配制提供指導作用。

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