抗菌肽在養豬生產中的應用

丁 雪，劉顯軍

（沈陽農業大學畜牧獸醫學院，沈陽 110866）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）最早由瑞典科學家Boman等[1]用大腸桿菌誘導惜古比天蠶分離獲得，是生物體免疫系統產生的分子質量較小，可以抵抗外界病原體侵害的，具有廣譜殺菌活性的一類堿性多肽，也是生物體天然免疫系統的重要組成部分。抗菌肽是生物體為適應環境、求得生存而產生的免疫活性分子，具有選擇性效應和無抗原性[2]。抗菌肽的作用機制與傳統抗生素完全不同，不易產生耐藥性，只對原核細胞和病變的真核細胞起作用，而對正常的真核細胞無影響。隨著抗生素的限用，抗菌肽以其獨特的殺菌機理作為新一代綠色抗微生物添加劑，在養豬生產上有著廣泛的應用前景。

1 抗菌肽的理化特性及結構

大多數抗菌肽具有熱穩定性，在100℃中加熱10～15 min仍能保持活性。多數抗菌肽表現較強的陽離子特性，對較大的離子強度和較高或較低的pH，均具有較強的抗性。但也有文獻報道，已發現了具有陰離子特性的抗菌肽類型，其作用機制與陽離子抗菌肽也不十分相同[3]。抗菌肽通常是由12～60個氨基酸組成，其N-末端富含賴氨酸、精氨酸和組氨酸等陽離子型氨基酸，其C-末端富含丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸等非極性氨基酸，而中間部分則富含脯氨酸。因此，大多數抗菌肽都是陽離子型的，通常帶有2～7個正電荷，等電點大于7[4]。另外，一些天然抗菌肽的C-末端往往呈酰胺化結構，這可能與其廣譜抗菌的活性有關。它們的二級結構分4種類型，即β-折疊、兩親性α-螺旋、擴展片層和環狀結構；三維構象可歸納為2種，即由疏水面和極性陽離子面相對而成的兩性結構和由正電荷區支托疏水核心組成的翅狀結構[5]。所有抗菌肽分子在二級結構上都有一個共同的特點，那就是其分子中的疏水部分與陽離子氨基酸部分分別位于分子結構的不同區域，形成了一個親分子的結構，即與水和脂類物質都具有親和力的結構，這也是抗菌肽發揮抗菌作用的基礎[6]。

2 抗菌肽的分類及來源

抗菌肽來源十分廣泛，從病毒、細菌、植物、昆蟲、軟體動物、甲殼動物、兩棲動物、魚類、鳥類及哺乳動物等生物均有發現[7]。目前已從動物、鳥類、植物與原核生物中分離到750多種抗菌肽。到目前為止，已經發現的抗菌肽有1 200多種。抗菌肽的分類方法有多種：根據氨基酸組成和結構特征可分為4類，即天蠶素、防御素、蛙皮素（富含脯氨酸）和蜂毒素（富含甘氨酸）；根據其作用對象的不同，抗菌肽可以分為抗細菌肽、抗真菌肽、抗腫瘤肽，既抗細菌又抗真菌的抗菌肽，既抗腫瘤又抗微生物的抗菌肽等類型。根據其來源不同又可將抗菌肽分為哺乳動物抗菌肽、兩棲類動物抗菌肽、昆蟲抗菌肽、植物抗菌肽、細菌抗菌肽和病毒抗菌肽等[8]。

3 抗菌肽的生物活性及作用機理

3.1 廣譜抗菌活性及作用機理

抗菌肽具有廣譜高效的抗菌活性[9-10]，不僅對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑制作用，還對真菌、原蟲也有廣泛的殺菌活性。如天蠶素在25～100 mg/L時對曲霉菌屬和鐮刀菌屬的病原菌有殺滅作用[11]。并且它的抗菌濃度小，抗菌濃度單位一般在μmol/L水平。抗菌肽的種類不同，其抗菌活性和抗菌譜有著很大差異。如在抗菌肽天蠶素A、B和D中，天蠶素A、B對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌（特別是革蘭氏陰性菌）有較大的殺傷力，而天蠶素D只對大腸桿菌有高效的溶菌活性[12-13]。抗菌肽不僅自身具有良好的抗菌活性，不同抗菌肽之間以及抗菌肽與傳統抗生素之間具有協同作用，兩者聯用可提高抗菌肽和傳統抗生素的藥物療效，甚至拓寬傳統抗生素的抗菌譜。在抗菌肽的抗菌作用機制研究中，普遍認為抗菌肽分子可在細菌細胞質膜上穿孔形成離子通道，造成細菌細胞膜結構破壞,引起細胞內水溶物質滲出,最終導致細菌死亡[14-15]。

3.2 抗病毒作用及其機理

研究表明，抗菌肽有抗病毒活性[16]。抗菌肽的抗病毒功能，可影響從核酸復制到病毒顆粒包裝的全過程。抗菌肽可通過與病毒外膜的直接結合發揮作用，例如，蛙皮素類抗菌肽和人的嗜中性粒細胞防御素（HNP-1）對皰疹病毒-HSV的抗病毒作用[17]。抗菌肽能抑制病毒的繁殖，如蜂毒素和天蠶素A在亞毒性濃度下通過阻遏基因表達來抑制HIV-1病毒的增殖[18]。抗菌肽還可模仿病毒粒子干擾其組合。在蜂毒素對煙草花葉病毒TMV抑制作用的研究中，發現煙草花葉病毒衣殼蛋白的部分氨基酸序列和蜂毒素序列存在相似性，而這部分序列在病毒顆粒組裝中與RNA和蛋白質結合密切相關。這樣蜂毒素蛋白分子可以偽裝成病毒包被蛋白，參與病毒合成，導致病毒顆粒無法正常組裝[19]。

3.3 抗腫瘤活性

抗菌肽對腫瘤細胞有明顯殺傷作用，而對正常細胞無害。這可能是因為真核細胞的質膜中含有豐富的膜蛋白和膽固醇，細胞中發達的微絲、微管與質膜結合，使得細胞膜比較穩定。正因為真核細胞有如此發達的細胞骨架，才不會被抗菌肽所溶解。但是，某些腫瘤細胞的細胞骨架系統不發達，抗菌肽可以插入癌細胞質膜，使雙分子層發生融解，腫瘤細胞的完整性被破壞，細胞膜上形成的孔洞使內容物外泄，線粒體出現空泡化、嵴脫落、核膜破損、界限模糊不清、核染色體DNA斷裂，并抑制染色體DNA的合成[20-22]。天蠶素、爪蛙素等表現出對腫瘤細胞如纖維瘤細胞、宮頸癌細胞、肺癌細胞等的殺傷作用。

4 抗菌肽在養豬生產中的應用

4.1 抗菌肽在飼料添加劑中的應用

飼料中長期添加抗生素類促生長添加劑會產生耐藥菌株、環境污染等嚴重后果。天然抗菌肽來源于動植物體，具有廣譜抗菌作用，對畜禽具有抑菌促生長的功能，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類環保型飼料添加劑。動物體內的抗菌肽能抑制外源性病原菌的侵害，而對動物腸道存在的正常菌群和細胞無害。雖然腸源抗菌肽有選擇性殺傷病原菌的優點，但其在動物體內的表達分泌量卻十分有限，很難以對動物自身的保健起很大作用[23]。因此，研究開發抗菌肽作為飼料添加劑對促進畜禽生長、改善畜產品品質、推動綠色畜牧業的發展具有重要意義。研究發現，抗菌肽在仔豬斷奶應激期間抗腹瀉效果較抗生素好，適量的抗菌肽比抗生素的促生長效果更理想。但高劑量的抗菌肽降低了仔豬的生長速度[24]。皮燦輝等（2008）研究認為，使用抗菌肽制劑6個月，能顯著提高母豬的豬瘟抗體水平，對母豬的生產性能及免疫功能有改善作用[25]。李波等在母豬分娩前30 d到產后21 d添加400 mg/kg天蠶素抗菌肽，發現天蠶素抗菌肽能夠提高母豬的繁殖性能和仔豬的生長性能等。綜合各項指標，母豬產前30 d和產后21 d添加400 kg/mg的天蠶素抗菌肽的上述指標均高于添加抗生素的對照組，說明在這個生產階段，天蠶素抗菌肽代替抗生素是可行的[26]。研究表明，在斷奶仔豬日糧中添加抗菌肽，結果表明添加0.3%天蠶素抗菌肽能夠提高斷奶仔豬生產性能、促進腸道菌群平衡、改善血清生化指標、提高機體免疫力并減少應激，從而促進豬健康生長[27]。應用含抗菌肽的柞蠶免疫血淋巴粉添加于斷奶仔豬料，飼喂試驗結果表明，柞蠶抗菌肽可減輕斷奶仔豬腹瀉[28-29]。

4.2 抗菌肽的藥用價值及其在豬病防治中的作用

仔豬腹瀉、豬瘟、藍耳病、豬瘟、圓環病毒2型感染、偽狂犬病及豬流感等疾病嚴重影響著養豬業的發展。長期廣泛地使用抗生素，導致有效劑量不斷加大，用藥成本急劇上升。在劑量不斷加大的同時，也增加了動物性食品抗生素的殘留，嚴重威脅了人類的健康。抗菌肽作為替代抗生素的新型藥物，在畜禽疾病防治中具有廣闊的應用前景。汪以真等（2004）將抗菌肽與抗生素在體外對大腸桿菌K88、大腸桿菌ATCC25922、豬霍亂沙門氏菌ATCC500、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌ATCC25923的效果進行了研究，結果表明，抗生素抗金黃色葡萄球菌的效果要好于抗菌肽，但對大腸桿菌的效果要差得多[30]。

5 抗菌肽的基因工程研究

抗菌肽天然產量很低，從生物體內分離抗菌肽不僅步驟繁瑣，產率較低，而且合成抗菌肽的價格又相當昂貴。因此，利用基因工程技術來生產抗菌肽具有廣闊的發展前景，它為抗菌肽的制備提供了新的途徑。目前，多種抗菌肽已在不同的表達體系中得到表達。但如何進一步提高表達水平，提高基因表達產物的穩定性和廣譜抗菌性，都是值得深入研究的問題。Yang等在2004年將人的陽離子抗菌肽hCAD-18/LL-37、凝血酶識別位點和硫氧還蛋白建構成表達載體pET-mh-CAD-18，然后在大腸桿菌中進行表達，獲得的融合蛋白經凝血酶消化后形成重組的GSLL-39，重組的GSLL-39與其天然形式相比，在N末端多出2個氨基酸殘基，但與其天然形式相似，具有抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的活性[31]。賴玉平等于2004年將從人汗腺中發現的抗菌肽DCD-1L基因克隆到畢赤酵母載體pPIC9中，并在畢赤酵母GS115中進行了表達。結果表明，GS115系統所表達的DCD-1L在pH 5.5～7.4范圍內，具有抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的活性[32]。這些研究結果為基因工程獲得的抗菌肽作為飼料添加劑或直接口服等應用的可能性提供了理論依據。

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