人源化鼠嵌合肝動物模型研究進展

李瑞生，李曉娟，沈宏輝，郭立新

(1.解放軍第302醫院實驗技術研究保障中心，北京 100039;2.北京大學首鋼醫院內分泌科，北京 1000144)

人源化鼠嵌合肝動物模型研究進展

李瑞生1，李曉娟1，沈宏輝1，郭立新2

(1.解放軍第302醫院實驗技術研究保障中心，北京 100039;2.北京大學首鋼醫院內分泌科，北京 1000144)

動物模型是人類疾病研究、發病機制、藥物研發的重要工具，對于困擾人類健康的肝臟疾病還沒有理想的動物模型能有效地反映出人類疾病發病的機制。建立人源化鼠嵌合肝動物模型，對于研究人類肝臟疾病的發病機制、疫苗和藥物的研發及疾病的診治等方面都具有十分廣闊的應用前景。

鼠嵌合肝;肝細胞移植;干細胞移植;模型，動物

人類動物模型是醫學研究和藥物研發的重要支撐條件，尤其對肝病學的研究起著非常重要的作用，很多重要的肝病研究成果均來源于建立的各種各樣的動物模型。但多數采用傳統方法復制的肝病動物模型與人類在生理結構、功能結構和病理變化等方面存在許多差異，其實驗結果不能完全準確地推導到人體，這樣就給人類肝病學的研究帶來許多不便。近年來人們采用人的原代肝細胞直接移植到模型動物體內形成人源化鼠嵌合肝動物模型，它可以在模型動物體內來研究人的肝細胞功能、藥物代謝動力學和嗜肝性病毒分型，并成為臨床前研究由模型動物到人類之間的一種重要載體和橋梁［1］。本文就人源化鼠嵌合肝的相關研究進行探討。

1 移植細胞

1.1 干細胞

人干細胞是一類具有無限期自我更新能力，能在體外長期培養、高度未分化的全能干細胞系。在適當條件刺激下可分化為各種類型的細胞。干細胞具有自我更新和自我維持能力，具有多分化潛能，具有生理性的更新能力、對損傷的修復能力和特定的微環境等特點［2］。干細胞的研究在動物體內進行能更真實地反映其表型和分化特點。干細胞移植要求動物具有免疫缺陷或免疫耐受，不易發生免疫逃逸，已植入的人干細胞才能在宿主內生長或形成嵌合體。

1.2 成熟肝細胞

成熟肝細胞移植后可呈克隆樣生長，但必須在肝臟受到中度損傷時才可以進行自身復制，一般為一到兩個周期。使用成熟肝細胞比其他肝細胞更方便、更容易獲得，如果采用在胚胎期建立免疫耐受鼠進行成熟肝細胞移植，將大大增加其移植成活率。

1.3 胚胎肝細胞

胚胎期的肝細胞具有很強的分化增殖能力，能夠抵御損傷，對許多激素和生長因子的誘導更加敏感［3］。早期、原始的胚胎干細胞(ES)增殖分化能力則更強于成熟肝細胞，更適易于進行肝細胞的移植。但胚胎肝細胞移植的研究大多集中于胚胎肝細胞移植后的功能表達，并未對胚胎肝細胞脾內移植后的增殖變化規律進行系統分析。

1.4 永生化肝細胞

肝細胞永生化是指體外培養的肝細胞經過自發或受外界因素的影響從增殖衰老危機中逃逸，從而具有無限增殖能力的過程。人肝細胞雖在體內有極強的增殖能力，但在體外培養時增殖困難。因此肝細胞自發永生化的幾率很小，通常要通過基因轉染，誘導衰老相關基因突變等方法來獲得細胞的“永生性”，以達到永生化的目的。目前應用最多的是SV40 T抗原基因轉染的永生化肝細胞［4］。

1.5 臍血干細胞

人臍帶血來源豐富、且富含人臍血干細胞(hUCBSCs)，臍血干細胞在誘導因子作用下可分化為肝細胞，用于終末期肝病的治療。臍血干細胞的含量高于骨髓，在鼠體內可以自分泌方式提供自身某些生長因子，促進自身增殖分化是比較理想的造血干細胞來源［5］。

2 受體鼠

選擇適當的移植細胞同時也應選擇適易的受體鼠才能形成好的人源化嵌合肝動物模型。由于肝細胞種屬的不同，移植后會受到受體鼠免疫系統的排斥。因此，應選擇具有免疫缺陷或誘導免疫耐受的鼠作為受體鼠。

2.1 免疫缺陷轉基因小鼠

尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子(uPA)轉基因小鼠:該鼠比正常小鼠的凝血時間長，血漿尿激酶型血漿素原激活劑活動度高，因此可致宿主肝細胞的損傷、肝功能缺陷，最終導致死亡。uPA轉基因小鼠與免疫缺陷背景(與SCID或RAG2小鼠雜交)小鼠結合后可作為人肝細胞移植的模型。Dandri M等［6］把人肝細胞移植 uPA/RAG-2轉基因鼠脾臟內，肝細胞會經血液流進肝臟而形成人源化嵌合肝鼠。而Brass V等［7］是把人肝細胞移植到SCID-AlbuPA轉基因雜交純合子鼠脾臟中(Alb-uPA轉基因鼠×聯合免疫缺陷鼠(Cb-17/SCID/bg)雜交)，建立了人源化嵌合肝鼠。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)基因剔除小鼠由于Fah的缺失，酪氨酸代謝受阻，導致酪氨酸在體內蓄積，而造成肝損傷［8］。Fah－/－純合子小鼠存在廣泛而持續的肝損傷，特別適合于移植細胞的再殖，是比較理想的肝臟再殖模型。

2.2 誘導免疫耐受大鼠

誘導免疫耐受大鼠的建立，主要在胚胎發育期通過采用人的胎肝細胞來誘導胎鼠對其產生免疫耐受，然后再把人的肝細胞植入受體鼠肝臟內，來建立免疫耐受大鼠動物模型［9］。該模型對多種肝炎致病因子易感，可進行已知和未知肝炎致病因子的研究。Ouyang EC 等［10］和蔣黎［11］均采用類似方法建立了大鼠的人鼠嵌合肝動物模型，且在大鼠肝臟中檢測到人肝臟的各種指標，還具有人肝臟的生物學功能，說明該模型能成功復制。

3 建立人源化鼠嵌合肝的途徑與方法

肝細胞移植的途徑主要有脾內、門靜脈、腹腔內、皮下和肌肉等，其效果最佳的是經脾內和門靜脈內移植［12］。主要是由于脾紅髓的網狀結構組織有利于細胞之間的相互作用和門靜脈血營養豐富，使得肝細胞植入受體鼠后，可表達Alb、酶及膽汁代謝。其分化、增殖潛能既受自身特性及活性影響，又受到受體鼠肝內環境的影響。

4 建立人源化嵌合肝鼠動物模型的關鍵

實驗證明移植肝細胞可在人源化嵌合鼠肝中存活，但存活時間較短，因此，如何來提高肝細胞的增殖能力及存活時間，是今后研究人鼠嵌合肝動物模型亟待解決的關鍵問題［13］。

4.1 提高肝細胞的活性及數量

移植肝細胞多采用凍存復蘇后的細胞，這就要求在解凍過程中速度要快來保持細胞的質量，為了保證肝細胞的質量，在凍存前可將肝細胞貼于微載體，目的是為了防止貼壁，這樣可明顯提高肝細胞凍存復蘇后的活性和數量［14］。

4.2 增加接種次數提高成活率

脾內移植的肝細胞數量因動物種屬不同而存在差異，植入肝細胞的數量也非常關鍵，如移植過多也會引起肝功能的損害造成肝細胞活性降低。Rajvanshi P等［15］采用分3次可達到宿主肝細胞量15%的肝細胞植入鼠脾內，結果顯示并沒有影響到移植肝細胞與受體鼠肝實質的結合，這樣就大大提高了移植細胞的成活率。

4.3 誘導移植細胞增殖

移植細胞在鼠肝內要大量增殖需要抑制宿主細胞增殖，同時要增加移植細胞的生長優勢。由于受體鼠內缺乏移植肝細胞生長所需的各種生長因子及營養激素，使得植入的肝細胞在體內增殖困難。對移植肝細胞的增殖，可采用手術、聯合細胞移植、應用外源性激素、轉基因肝細胞移植和化學性肝損傷等外源性刺激來誘導［16］。而再生刺激不僅對抑制細胞有加速增殖作用，對宿主細胞也具有同樣的作用，因此應先使用生物堿、絲裂霉素和放射線等措施來抑制受體鼠肝細胞的增殖，然后再進行外源性刺激，這樣可大大提高移植肝細胞在體內的增殖［17］。

4.4 移植肝細胞的檢測與鑒定

移植肝細胞在受體鼠內是否成活可采用免疫組化技術、Western印跡技術和RT-PCR檢測技術來檢測受體鼠肝組織中人的肝細胞角蛋白(CK18)、人Alb和人Alb mRNA，檢測鼠肝組織基因組人特異性Alu序列。其檢測結果完全能反映人肝細胞在鼠肝組織中的表達，提示該模型建立的質量。鼠肝體內發育成活的移植肝細胞通常采用定量和標記技術來鑒定。細胞光度測量技術可以鑒定移植肝細胞的數量和特性，并在此基礎上分離移植的肝細胞;而標記鑒定技術主要借助熒光顯微鏡，更直觀更清晰地對人肝細胞與受體肝細胞進行分析鑒定［18］。

5 應用前景

人鼠嵌合肝動物模型的成功建立，不僅可進行人類嗜肝病毒、病毒性肝炎等肝病方面的研究，還可用以比較人和嚙齒類動物肝細胞在代謝途徑、速度、代謝產物上的差異，評估人源化鼠肝的代謝狀況，而且對肝臟細胞生物學理論的研究及重大肝病的臨床診治都具有十分重要的意義。雖然目前人源化鼠嵌合肝細胞的存活時間較短，其移植肝細胞的成活率僅占15%，但是如何改進實驗設計、提高嵌合肝中人肝細胞的比例、產生足夠實驗用的異種肝內人肝細胞群、完善對人鼠嵌合肝的檢測手段和人鼠嵌合肝動物模型，最終能夠達到完全用于人肝細胞在實驗動物體內重建人肝組織是今后研究的重點，這將對人類肝病的治療具有非常好的應用前景。

［1］張海斌，何志穎，楊廣順.人源化肝臟嵌合體小鼠的研究進展［J］.中華肝臟病雜志，2011，19(5):398－400.

［2］姚鵬.干細胞移植與肝臟疾病［J］.中華肝臟病雜志，2007，15(3):219－220.

［3］林滬，毛青，王宇明.人鼠嵌合肝模型的建立與鑒定［J］.中華傳染病雜志，2007，25(8):510－512.

［4］Mikula M，Fuchs E，Huber H，et al.Immortalized p19ARF null hepatocytes restore liver injury and generate hepatic progenitors after transplantation［J］.Hepatology，2004，39:628－634.

［5］楊尚琪，夏穗生.T淋巴細胞疫苗誘導大鼠移植心存活時間延長的機制探討［J］.中華器官移植雜志，2000，21(5):303.

［6］Dandri M，Burda MR，Torok E，et al.Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and in vivo infection with hepatitis B virus［J］.Hepatology，200l，33:981－988.

［7］Mercer DF，Schiller DE，Elliott JF，et al.Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers［J］.Nat Med，2001，7:927－933.

［8］Meuleman P，Libbrecht L，De Vos R，et al.Morphological and biochemical characterization of a human liver in a uPA-SCID mouse chimera［J］.Hepatology，2005，41:847－856.

［9］Wu GY，Konishi M，Walton CM，et al.A novel immunocompetent rat model of HCV infection and hepatitis［J］.Gastroenterology，2005，128:1416－1423.

［10］Ouyang EC，Wu CH，Walton C，et al.Transplantation of human hepatcotyes into toleirzed genetically immuncomeptent rats［J］.World J Gastroenterol，2001，7:324－330.

［11］蔣黎，毛青，王宇明，等.HBV感染的人鼠嵌合肝動物模型的建立［J］.第三軍醫大學學報，2003，25:38.

［12］周曉東，佘麗君.肝細胞移植的細胞來源與適應癥［J］.中華肝病雜志，2003，11:368.

［13］林滬，毛青，王宇明.人鼠嵌合肝研究進展［J］.世界華人消化雜志，2005，13(12):1373－1376.

［14］Selden C，Hodgson H.Cellular therapies for liver replacement［J］.Transpl Immunol，2004，12:273－288.

［15］Rajvanshi P，Kerr A，Bhargava KK，et al.Efficacy and safety of repeated hepatocyte trans plantation for significant liver repopulation in rodents［J］.Gastroenterology，1999，111:1092－1102.

［16］Guha C，Deb NJ，Sappal BS，et al.Amplification of engrafted hepatocytes by preparative manipulation of the host liver［J］.Artif organs，2001，25:522－528.

［17］Witek RP，Fisher SH，Petersen BE.Monocrotaline，an alternative to retrorsine-based trans plantation in rodents［J］.Cell Transplant，2005，14:41－47.

［18］Oertel M，Rosencrantz R，Chen YQ，et al.Repopulation of rat liver by fet al hepatoblasts and adult hepotacytes transduced ex vivo with lentiviral vectors［J］.Hepatology，2003，37:994－1005.

Research Progression of Establishment of Animal model of Tolerant Rats with Chimeric Human Liver

LI Rui-sheng1，LI Xiao-juan1，SHEN Hong-hui1，GUO Li-xin2
(1.Experimental Research Support Center，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China;2.Peking University Shougang Hospital endocrine department，Beijing 100144，China)

Animal model is an important instrument for human diseases research，pathogenesis，medicine research.At present，liver diseases still damage human healthy seriously because there are no proper animal models to effectively reflect procedures of human diseases.Therefore establishment of animal model of tolerant rats with chimeric human liver will have extensive application prospects for pathogenesis of human liver diseases，vaccine and medicine exploitation and treatment of human liver diseases.

Mice chimeric liver;Hepatocyte transplantation;Stem cell transplantation;Model，animal

R332

A

1671-7856(2012)07-0072-03

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.018

2012-07-06

李瑞生(1969－)，男，副研究員，博士，研究方向:主要從事實驗動物遺傳監測與模型研究，E-mail:lrsheng@sohu.com。

李瑞生。