microRNA在乳腺癌診斷及預后判斷中的作用

曹志剛 綜述 邵志敏 審校

復旦大學附屬腫瘤醫院乳腺外科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海200032

2008年全球乳腺癌新發病例138萬，占女性癌癥發病總數的23%；46萬人死于該病，占女性癌癥死亡人數的14%［1］。在中國的上海等大中城市，乳腺癌患病率已連續20年位居女性惡性腫瘤第一位［2］，嚴重危害廣大女性的健康。近年來研究發現，微小RNA(microRNA，miRNA)分子調控人體基因組內約1/3的基因表達［3］，其與乳腺癌的發生、發展、侵襲及轉移密切相關［4-6］，這對進一步認識乳腺癌的發病機制、診斷、治療和預后判斷都有重要意義。目前已知影響乳腺癌預后的因子有多種，主要分為臨床病理學和生物學兩類。生物學因子主要表現在DNA和RNA水平，而miRNA作為一種新型的腫瘤標志物因其特殊的穩定性及特異性已顯示了特有的優越性。本文就miRNA在乳腺癌診斷及預后判斷中的作用作一綜述。

1 miRNA分子概述

miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)轉錄的，一般最初產物為大的具有帽子結構和多聚腺苷酸尾的pri-miRNA。這些pri-miRNA在RNase Ⅲ Drosha和其輔助因子Pasha的作用下，被處理成70個核苷酸組成的pre-miRNA前體產物。在核膜轉運蛋白的幫助下前體分子被輸送到細胞質中。隨后另一個RNaseⅢ Dicer將其剪切產生約為22個核苷酸長度的雙鏈。這種雙鏈很快被引導進入RNA誘導沉默復合體(miRISC)中，成熟的單鏈miRNA保留在這一復合物中［7-9］。

目前的研究認為miRNA主要通過兩種機制進行基因表達的調控［10］，①miRNA序列與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(3'untranslated region，3'-UTR) 結合，如果兩者堿基序列完全互補，miRNA則促使靶基因的mRNA發生降解；②miRNA與靶基因mRNA的3'-UTR的結合，堿基序列不完全互補，則阻止靶基因mRNA的翻譯，但不影響其穩定性。miRNA的表達失調，可引起大量相關基因的表達異常，導致細胞功能的紊亂，甚至出現癌變。

應用miRNA芯片技術和實時定量PCR等方法檢測乳腺癌及癌旁組織miRNA的差異性表達，可發現一些與乳腺癌相關的miRNA。Calin等［11］通過分析miRNA在染色體上的定位與腫瘤發生的關系，發現186個miRNA基因中15個miRNA定位于10個與人類乳腺癌相關的缺失區。Iorio等［12］運用miRNA基因芯片及Northern blot等方法對76例乳腺癌樣本和10例乳腺正常標本進行miRNA表達譜分析，發現29種miRNA的表達有顯著變化，且有15種miRNA可以明確區分腫瘤或正常乳腺樣本，其中miR-10b、miR-125b和miR-145在大多數乳腺癌組織和細胞中顯著低表達，而miR-21和miR-155表達量則明顯下降。這表明在腫瘤發生、發展過程中，起癌基因與抑癌基因作用的miRNA都發揮著至關重要的調控作用，此外也揭示這些miRNA與乳腺腫瘤的分級、分期、血管侵襲性及腫瘤細胞增殖和雌、孕激素的表達等臨床病理指數均相關。越來越多的研究證實，miRNA與乳腺癌的侵襲轉移也密切相關，miR-21、miR-10b、miR-373、miR-520c等在轉移性乳腺癌中表達上調，促進乳腺癌的侵襲、遷移［13-15］；而miR-31、miR-126、miR-335在轉移性乳腺癌中表達明顯下調，體內實驗發現其可以抑制乳腺癌的轉移［16-19］。有趣的是，miR-200家族在腫瘤轉移過程中扮演了一個“兩面派”的角色［20］，一方面miR-200s能減緩原發性乳腺癌細胞向血液循環系統的初始逃逸，抑制這個過程中癌癥的擴散速度；另一方面當癌細胞已經逃逸時，尋找新的“殖民地”(如肺部)的時候，這個相同的小分子竟又能夠幫助促進這個過程。

2 miRNA與乳腺癌的診斷

現有研究已經顯示miRNA可作為“癌癥指紋”，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測成本較低的優點，是一種新型的腫瘤生物標志物，在腫瘤的診斷中有潛在的應用價值。

2.1 組織miRNA表達與乳腺癌的診斷

Rosenfeld等［21］報道了基于253例不同腫瘤樣本的48種miRNA 表達譜結果，根據上述結果對轉移灶進行的雙盲驗證發現，基于miRNA的未知來源轉移灶分類的準確性超過了90%，顯示miRNA在腫瘤診斷中的巨大應用前景。Yan等［22］分析了113例乳腺癌標本的miRNA表達譜，在這些異常表達的miRNA中，miR-21的上調最明顯，同時還發現，miR-21的高表達與乳腺癌的臨床病理特征，如惡性臨床分期、淋巴結轉移顯著相關。Imam等［23］研究分析發現，在乳腺癌組織中miR-185表達明顯下降，其靶基因表達水平則明顯上升。有學者鑒定了13 種miRNA在炎性乳腺癌和非炎性乳腺癌組織中的表達情況，一共檢測了17 295對miRNA-mRNA，發現有10 283對呈正相關，7 012對呈負相關；其中miR-29a、miR-30b、miR-342-3p和miR-520-5p的靶基因與預測的相同；miR-335、miR-548d-5p和miR-451在炎性乳腺癌中過表達，miR-15a、miR-24、miR-29a、miR-30b、miR-320、miR-342-5p、miR-342-3p、miR-337-5p 和miR-520a-5p在炎性乳腺癌中低表達，為乳腺癌的診斷提供了重要的依據［24］。Sempere等［25］對100多例乳腺癌患者的標本利用原位雜交法測定miRNA的表達情況，結果顯示miR-21在乳腺癌組織中表達增加，而let-7表達減少，miR-145和miR-205在正常乳房導管及小葉肌上皮和基底細胞層表達，而在對應的乳腺癌標本中表達下降或完全不表達，其研究還發現miR-145在非典型性增生和乳腺癌中表達明顯增加，這提示miR-145可能有希望作為乳腺癌新的早期診斷標志物。Blenkiraon等［26］研究表明miRNA表達譜還可以區分乳腺癌的5個亞型，即luminalA型、luminalB型、HER-2過表達型、Basal-like型(三陰型)和Normal-like型，為乳腺癌的分子分型及個體化治療提供了理論依據。

2.2 血清miRNA表達與乳腺癌的診斷

miRNA在血清中可長期穩定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反復凍融、酸堿環境、長期保存等各種處理方法均不會造成血清miRNA的損失［27］。由于腫瘤存在高度異質性，組織學取材不能完全代表整體腫瘤組織，而外周血腫瘤核酸可起源于腫瘤內部任何一個亞克隆的群體，因此能更全面反映腫瘤組織豐富的異常分子改變［28］。

至今已報道的多項血清microRNA 與腫瘤的研究工作，為血清miRNA作為分子標志應用于腫瘤的早期診斷和預后判斷提供了工作基礎。Zhou等［29］在肝癌血漿中篩選到了由7個microRNA組成的早期肝癌診斷分子標志物，并利用這7個血漿microRNA建立了一個診斷模型，對于<2 cm的肝癌診斷準確率接近90%，效果優于傳統的AFP。Zhu等［30］對乳腺癌患者血清miR-155的含量進行了小樣本的研究，發現血清miR-155 水平在乳腺癌患者和非乳腺癌患者中差異無統計學意義(P>0.05)，但在癌組織孕酮受體陽性的患者中血清含量要高于陰性患者，提示miR-155 可以作為區分激素敏感性和非敏感性的乳腺癌患者的分子標志物，進一步證明血清microRNA 具有成為腫瘤診斷標志物的潛力。Heneghan等［31］挑選了與乳腺癌相關的7個miRNA在乳腺癌患者的腫瘤組織和血漿中進行了比對，發現miR-195 是乳腺癌組織特異的miRNA，在血漿中的水平高于正常水平，能很好地反映患者腫瘤生長的臨床病理特征。Zhao等［32］通過比較20例早期乳腺癌患者(10例美國白人和10例美國黑人)以及相應匹配的20例健康人群(10例美國白人和10例美國黑人)的血清miRNA表達發現，血清循環miRNA可以作為潛在的乳腺癌早期診斷的新的無創性生物標志物；研究結果還發現，在美國白人中有31個差異表達的miRNA(17個表達上調，14個表達下調)，在美國黑人中有18個差異表達的miRNA(9個表達上調，9個表達下調)，有趣的是，僅有2種miRNA在美國黑人和白人中均有差異表達，提示血清miRNA的表達具有種族差異性。Schrauder等［33］通過miRNA表達譜檢測了早期乳腺癌和健康對照外周血miRNA的表達，結果提示有59個miRNA有差異表達，其中13個顯著上調，46個顯著下調；通過RBF核函數的支持向量機技術建立模型，其特異度為78.8%，靈敏度為92.5%，準確率為85.6%。Schwarzenbach等［34］發現血清miR-214表達水平可以區分乳腺癌、乳腺良性腫瘤及健康對照人群，ROC曲線下面積為0.878和0.883，結果提示血清游離miR-214是潛在的乳腺癌診斷標志。有學者發現miR-215、miR-299-5p、miR-411和miR-452在乳腺癌組織和血清中存在差異表達，能夠幫助區分乳腺癌患者和健康對照，尤其是血清miR-452的異常表達能夠提示乳腺癌患者是否發生體內轉移［35］。

3 miRNA與乳腺癌的預后判斷

特定的miRNAs表達模式與腫瘤的預后相關，因此miRNAs還可能有助于乳腺癌的預后判斷。Camps等［36］分析了219例乳腺癌患者預后發現，miR-210與HIF-1a信號通路相關，miR-210的表達水平與乳腺癌的無病生存率和總生存率呈負相關。因此，miR-210可能是乳腺癌預后差的一個獨立預測因子。Toyama等［37］檢測了58例三陰性乳腺癌患者及103例ER陽性HER2陰性患者miR-210表達情況及其與臨床病理的關系，證實miR-210在三陰性乳腺癌的表達水平顯著高于ER陽性HER2陰性乳腺癌患者(P<0.001)，也提示了miR-210表達與無病生存期和整體生存顯著負相關，miR-210高表達預示預后不良。Valastyan等［19］發現miR-31在轉移性乳腺癌細胞中表達明顯下調，且miR-31與乳腺癌的無轉移生存率呈負相關，miR-31可能是各種亞型乳腺癌轉移的分子標志，用來判斷乳腺癌的預后。Yan等［22］和Lee等［38］均發現miR-21的高表達與乳腺癌的臨床病理特征，如惡性臨床分期、淋巴結轉移、預后差顯著相關。有報道顯示，在246例進展期ER陽性、接受他莫昔芬治療的患者中，miR-30c能夠獨立預測無疾病進展存活期［39］。Svoboda等［40］利用qRT-PCR方法檢測了39例三陰性乳腺癌患者miR-34a、miR-34b、miR-34c的表達水平，結果顯示miR-34b表達與無病生存期和整體生存顯著負相關，提示miR-34b可作為預測三陰性乳腺癌患者預后新的標志物。Buffa等［41］報道了利用乳腺癌完整的mRNA和miRNA表達譜確定了miRNA相關的進展途徑和潛在治療靶點，發現在雌激素受體陽性患者有4個miRNA、雌激素受體陰性患者有6個miRNA與無遠處復發生密切相關，在三陰性乳腺癌中miR-342，miR-27b及miR-150可以作為預后標志；其他幾個獨立研究也證實，miR-210，miR-128a和miR-27b及其靶基因都具有預后標志的作用。Hanna等［42］利用組織芯片方法檢測了473例乳腺癌患者組織miR-21、miR-92a、miR-34a和miR-221的表達水平，結果提示，miR-221是乳腺癌獨立的預后因素。Volinia等［43］研究發現9個miRNA在原位癌及浸潤癌組織中差異表達，其中let-7d、miR-210和miR-221在原位癌中表達下調，在浸潤癌中表達上調；同時提示，miR-210、miR-21、miR-106b、miR-197和 let-7i可以作為預后的生物標志；miR-210與腫瘤的侵襲有關，miR-210的靶基因BRCA1、FANCD、FANCF、PARP1、E-cadherin和Rb1在原位癌中高表達，在轉移灶中表達下調。

4 展望

對miRNA的深入研究無疑能增進對乳腺癌發生、發展、轉歸等機制的認識，促進診斷和治療的快速發展。當然，作為敏感性較高的分子標志，其統一的檢測標準及嚴格的質控標準仍需時日得以公認。此外，miRNA與臨床相關的研究剛剛起步，尚缺乏大樣本、多中心、前瞻性的研究數據。隨著miRNAs微陣列、實時熒光定量RT-PCR、SNP分析和Northern blot 等各種技術平臺的不斷發展，miRNAs表達的檢測日益精確可靠，將為乳腺癌的診斷和預后判斷開辟了新途徑，相信不久的將來，隨著越來越多的可靠數據的產生，miRNA作為乳腺癌診斷、治療、療效預測及預后判斷的重要分子標志物可得到極大程度的認可和推廣。

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