腎臟纖維化與間充質轉分化

封怡多，張東亮，劉文虎

腎臟纖維化以腎小球硬化及腎小管間質纖維化 (renal interstitial fibrosis，RIF)為主要特征，是各種慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)發展為終末期腎病 (end－stage renal disease，ESRD)的共同途徑。近幾年，上皮間充質轉分化 (epithelial－mesenchymal transition，EMT)被認為是受損腎臟產生肌成纖維細胞的關鍵。但新近研究表明，內皮細胞與足細胞也可發生間充質轉分化［1－3］，導致腎小球硬化以及蛋白尿。本文對腎臟間充質轉分化最新觀點以及可能的治療靶點做一綜述。

1 腎臟實質細胞與EMT

1.1 腎小管上皮細胞與EMT 大量研究證實，腎小管上皮細胞在體外經過轉化生長因子β(TGF－β)刺激后可發生表型轉化，這種轉變以失去上皮細胞表型如E－cadherin、zonula occludens－1(ZO －1)等和獲得間充質細胞表型如α平滑肌肌動蛋白 (α－SMA)、成纖維細胞特異性蛋白－1(FSP－1)、間質細胞I型膠原等為特征［4－5］。

Strutz等［3］在抗腎小管基底膜疾病的小鼠模型中發現FSP－1可以在腎小管上皮細胞表達，首次證實EMT參與腎纖維化的形成。隨后，Lan等［6］在大鼠5/6腎切除腎小球硬化模型中提供了EMT存在的形態學和表型轉化的證據。Rastaldi等［7］報道了133例不同腎病患者腎活檢結果，發現具有EMT特性的腎小管上皮數量與血清肌酐濃度及腎間質損害程度密切相關，表明EMT參與人腎臟纖維化過程。

1.2 內皮細胞與EMT 新近研究表明，通過內皮細胞－間充質轉分化 (endothelial－to－mesenchymaltransition，EndoMT)，內皮細胞可表達成纖維細胞的標志物。Zeisberg等［1］使用了3種小鼠CKD模型來證明EndoMT對腎臟纖維化的作用，發現30%～50%成纖維細胞既表達內皮細胞標志CD31，又表達成纖維細胞和肌成纖維細胞標志，如FSP1和α－SMA。用Tie2－Cre追蹤標記內皮細胞和R26R－stop－EYFP轉基因小鼠也證明內皮細胞可以轉分化為成纖維細胞，證實EndoMT在腎臟纖維化過程中對成纖維細胞和肌成纖維細胞的產生和積聚起著重要的作用。研究證實，EndoMT和EMT一樣，也可被TGF－β誘導產生，抑制TGF－β/Smad通路有可能對抑制組織纖維化甚至腫瘤形成有積極的作用［8］。研究證實，EndoMT在糖尿病腎臟纖維化早期的發生發展過程中起重要作用［9－10］。

1.3 足細胞與EMT 足細胞的功能缺失在蛋白尿形成以及腎小球硬化的發生發展中起重要作用，可最終引起腎臟纖維化。研究表明腎小球足細胞也可發生表型的改變，并導致足細胞功能的缺失。體外培養的足細胞中加入TGF－β1后，細胞間隙增大，伴隨P－cadherin、ZO－1的產生;與此同時，細胞開始表達間質纖維蛋白desmin、基質金屬蛋白酶－9(MMP－9)、I型膠原和正調節轉錄因子Snail，最終可損傷足細胞濾過屏障［2］。在糖尿病腎病以及局灶性節段性腎小球硬化 (FSGS)等以蛋白尿為主要表現的腎小球疾病中也可觀察到腎小球足細胞表型的改變，伴有明顯的足細胞形態和功能異常。Yamaguchi等［9］對49例糖尿病患者進行了腎活檢，證實其腎組織以及尿中足細胞的FSP－1表型陽性率與糖尿病所致腎損害嚴重程度呈正相關。此外，ILK(integrinlinked kinase)信號通路在足細胞表型改變中起重要作用，ILK的上調可引起腎小球足細胞的間充質轉分化、細胞遷移以及功能缺失等，提示ILK可能是蛋白尿相關腎臟疾病的有效治療靶點［11－12］。

然而，目前對足細胞EMT的概念仍存在爭論。雖然體外培養的足細胞正常形態呈鋪路石狀，然而分化的足細胞形成許多紡錘樣突起，而且體內的正常足細胞具有多級足突并且表達少量波形蛋白 (vimentin)，所以，與腎小管上皮細胞比較，足細胞本身具有更多的間充質細胞的性狀，在被損傷或患病后，這些間充質標志物表達會進一步上調。不同于小管上皮細胞EMT后侵入腎間質并轉變為成纖維細胞，足細胞EMT后反而獲得自動性，導致其從腎小球基底膜 (GBM)上脫落并被沖入尿液中排出體外［13］。

2 EMT的細胞內信號轉導及機制

目前關于EMT的分子生物學機制研究已經較為深入，在CKD的機體環境中，主要存在的傳導通路有 TGF－β/Smad、integrin/ILK信號通路等，這些信號傳導途徑是相互聯系的一個整體，控制EMT的轉錄調節和信號傳導。

2.1 TGF－β與EMT TGF－β是多功能的細胞因子，除了可使成纖維細胞聚集和增殖外，還可通過EMT途徑導致組織的纖維化［14］。大量動物實驗及臨床研究證實TGF－β在CKD中的表達顯著增高，推斷TGF－β引起的EMT在腎臟纖維化的發病機制中起到了關鍵作用。

2.2 TGF－β/Smads通路與EMT 在纖維化的腎臟中，TGF－β的表達普遍上調。TGF－β與跨膜受體Ⅰ (TβRⅠ)和跨膜受體Ⅱ (TβRⅡ)相結合，TβRⅡ使TβRⅠ磷酸化，誘導Smad2和Smad3磷酸化和激活，磷酸化的Smad2或Smad3與Smad4結合后轉移到核內，在核內調節TGF－β相關的基因轉錄。而 Smad6及Smad7可阻礙Smad2、Smad3與TβRⅠ的結合從而抑制EMT的發生。與TGF－β在EMT中的誘導作用相一致，這些相關受體以及Smad家族也在EMT中發揮著很重要的作用。

研究證實，Smad突變體的表達可以干擾Smad的功能，應用小干擾RNA下調Smad的表達同樣可以抑制上皮細胞向間充質細胞的表型轉換［15－16］。然而一些研究發現，Smad2可以作為TGF－β的拮抗體影響TGF－β所致的EMT過程，其機制可能與Smad2的缺失增強了Smad3及Smad4的表達有關［17］。另外，抑制體Smad7的高表達可抑制各種上皮細胞中TGF－β所致的 EMT。在受損的腎臟中Smad表達亢進，不僅是因為TGF－β的表達上調，還因為Smad相互調節失衡。Smad信號還可通過肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和骨形態蛋白7(bone morphogenic protein－7，BMP －7) 抑制 EMT［15－16］。

2.3 導致EMT的其他信號通路 ILK是一種細胞內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究表明integrin/ILK信號通路在TGF－β所致的EMT中起關鍵作用，TGF－β可通過Smad依賴性信號通路促進ILK的表達，引起間充質轉分化。另外，ILK可導致基質金屬蛋白酶－2(MMP－2)表達，促使細胞在基底膜基質中發生細胞遷移及浸潤。

其他諸如 Wnt/β－catenin信號通路在腎小管和足細胞EMT中的潛在作用目前仍不十分肯定［18］。胞內的多種信號通路相互聯系、相互作用，激活β連環蛋白，從而影響許多β連環蛋白目的基因的表達，如 Snail1、Twist等，最終導致EMT轉錄途徑的激活。

3 腎臟纖維化的EMT治療靶點

EMT包含了大量的胞內信號級聯反應及調節機制，理論上阻斷其中任何一步均可能削弱EMT過程，防止纖維化的發生。很多研究試圖通過抑制TGF－β阻止腎纖維化進展，包括反義核苷酸、抗TGF－β抗體等，然而研究發現長期抑制TGF－β會誘發炎癥。有研究證實阻斷Smad信號通路后發現可延緩腎臟纖維化，如Li等［19］發現Smad3特異性抑制物SIS3可有效抑制Smad3的磷酸化，抑制EndoMT的發生，在鏈霉素誘導的糖尿病腎病模型中阻止了腎臟結構的改變，起到了保護腎臟功能的作用。另有研究表明，應用小分子抑制劑 QLT－0267抑制 ILK，可廢除TGF－β所致的cyclinD1的表達，在很大程度上保留了E－cadherin及閉鎖小帶的表達。在梗阻性腎病模型的大鼠體內，QLT－0267抑制了β－catenin的積聚，抑制了Snail1、α－SMA、粘連蛋白、vimentin以及Ⅰ型和Ⅱ型膠原的表達［20］。此外，最近研究發現了一些內源性抗纖維化蛋白，尤其是肝細胞生長因子 (HGF)和BMP－7，能拮抗TGF－β的促纖維化作用，而C－肽 (C－peptide)及骨形成蛋白－2(BMP－2)等因子可通過修飾TGF－β信號通路阻礙EMT的發生［21］。

4 前景與展望

腎小管上皮細胞、內皮細胞、足細胞均可發生間充質轉分化。TGF－β/Smad、integrin/ILK等信號傳導對EMT起著重要的介導作用。這些研究將為抑制和逆轉腎臟間充質轉分化提供新的線索，最終將為臨床治療腎臟纖維化提供新的干預手段。如能尋找到有效的逆轉間充質轉分化的方法將使CKD的治療登上一個新的臺階。

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